表达与纯化midnolin-蛋白酶体复合物
获得用于结构解析和生化分析的内源性或重组midnolin-26S蛋白酶体复合物。
在HEK293F细胞中通过BacMam系统表达midnolin（含mCherry/His/Strep标签），用MG132和PMA处理，通过两步亲和层析和凝胶过滤纯化复合物。
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midnolin-蛋白酶体在泛素非依赖性底物周转过程中的结构动力学
Structural dynamics of the midnolin-proteasome during ubiquitin-independent substrate turnover.
实验完整度
高包含多种独立证据层级：冷冻电镜结构解析（多个状态）、生化结合实验（ITC/SPR）、体外蛋白酶体活性测定、突变体功能验证及体内共表达分析。
主要模型
HEK293F细胞表达系统 人类26S蛋白酶体 midnolin-EGR1(101-200)复合物 EGR1(101-200)-mCherry底物
重点核对
midnolin的αHelix-C（残基337-468）与RPN1（PSMD2）的结合亲和力（ITC: ~130-146 nM，SPR: 390-663 nM） Ubl结构域残基P100/V102/A104对刺激蛋白酶体活性的必要性（突变体显著降低活性） Catch结构域对底物高效降解的必需性（Catch缺失或替换突变体活性显著降低） MG132处理对蛋白酶体状态分布的影响（可能产生变构效应） ATP水解与Mg²⁺释放协同驱动底物转运（观察到的四个连续构象状态）
摘要
26S蛋白酶体通常降解带有泛素链标记的蛋白质。然而，存在一条由衔接蛋白midnolin介导的、针对核蛋白的独特的泛素非依赖性降解途径，但其分子机制仍知之甚少。在此，我们展示了人类26S蛋白酶体与midnolin复合物的九个冷冻电镜结构，这些结构共同描绘了一个近乎完整的催化循环。我们的结构揭示，midnolin通过其C末端螺旋与RPN1亚基结合到蛋白酶体上，其泛素样结构域以非催化角色与RPN11去泛素化酶相互作用。这种相互作用将负责底物结合的相邻Catch结构域直接定位在蛋白酶体入口上方，可能促进底物进入蛋白酶体。此外，我们观察到底物转运过程中AAA+ ATP酶六聚体的四个连续的螺旋阶梯构象。这些发现为泛素非依赖性核蛋白降解机制提供了见解，并可能有助于开发通过蛋白酶体直接降解靶向核蛋白的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- midnolin如何介导泛素非依赖性蛋白降解，其分子机制及动态过程尚不清楚。
- 核心机制
- midnolin通过αHelix-C锚定到蛋白酶体RPN1亚基，Ubl结构域与RPN11结合，将Catch结构域定位在底物入口处，促进底物进入；AAA+ ATP酶通过ATP水解和Mg²⁺释放驱动的手拉手机制进行底物转运。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构（多个状态）、ITC和SPR结合实验、体外蛋白酶体活性测定（Suc-LLVY-AMC水解）及突变体（Ubl和Catch等）的功能验证。
- 研究意义
- 揭示泛素非依赖性核蛋白降解的结构基础，为设计靶向核蛋白（如MYC和p53）的直接蛋白酶体降解策略提供思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜结构解析
确定midnolin-26S蛋白酶体在不同功能状态下的高分辨率结构。
使用单颗粒冷冻电镜技术，对纯化的复合物进行数据采集和处理，通过3D分类获得多个构象状态（如PSRPT1, PSRPT5等），并进行局部细化。
结合亲和力测定
定量分析midnolin与RPN1之间的结合强度和动力学。
使用等温滴定量热法（ITC）和表面等离子体共振（SPR）测量midnolin C端截短体与RPN1的相互作用。
体外蛋白酶体活性测定
评估midnolin及其突变体对26S蛋白酶体肽酶活性的刺激作用。
将纯化的26S蛋白酶体与midnolin或突变体（及底物）孵育，加入荧光底物Suc-LLVY-AMC，监测荧光随时间的变化。
功能验证突变体
验证关键残基或结构域（如αHelix-C、Ubl、Catch）在蛋白酶体活性刺激和底物降解中的功能。
设计并纯化突变体（如MIDNK391E/L395E/R409E，MIDNP100E/V102E/A104E，MIDNΔ(112-336)，Catch-replaced），比较其刺激蛋白酶体活性的能力。
底物结合与稳定分析
研究底物结合对midnolin稳定性及功能的影响。
通过凝胶过滤分析单独表达与共表达Catch-EGR1(101–200)的特性，并用nanoDSF测量热稳定性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样品表达与处理 | MG132 | TargetMol | T2154 |
| 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | MedChem Express | HY-18739 | |
| 样品表达 | 丁酸钠 | Sigma-Aldrich | 303410-500G |
| 蛋白质纯化 | Ni²⁺-IDA树脂 | Smart-Lifescience | SA052100 |
| Strep-Tactin XT 柱 | IBA Lifesciences | 2-5010-010 | |
| 生物素 | innochem | A84479 | |
| Benzonase 核酸酶 | Sino Biological | SSNP01-50KU | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL 凝胶过滤柱 | -- | -- | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL 凝胶过滤柱 | -- | -- | |
| 蛋白质浓度测定 | Bradford 蛋白定量试剂盒 | Yeasen | 20201ES76 |
| 细胞培养 | LB培养基 | -- | -- |
| 蛋白表达诱导 | 异丙基硫代半乳糖苷 | INALCO | -- |
| 冷冻电镜 | Titan Krios 透射电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Gatan K3 直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| GIF Quantum 能量过滤器 | Gatan | -- | |
| Quantifoil R1.2/1.3 300目金网 | Quantifoil | -- | |
| Vitrobot 冷冻制样仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 负染色 | JEM1400PLUS 透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| SPR | CM5 传感芯片 | Cytiva | -- |
| 蛋白稳定性 | Prometheus NT.48 仪器 | NanoTemper Technologies | -- |
| 蛋白质纯化 | Amicon Ultra-15 超滤管 | Merck Millipore | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| midnolin-蛋白酶体复合物表达和纯化 | 细胞密度、MG132和PMA浓度及处理时间、裂解缓冲液组成 阅读提示：Methods: Expression and purification of human MIDN-proteasome complex |
| 冷冻电镜样品制备和数据收集 | 样品浓度、孵育比例和时间、网格类型、冷冻条件 阅读提示：Methods: Cryo-EM sample preparation and data collection |
| 体外活性测定 | 蛋白酶体和midnolin浓度、底物浓度、缓冲液组分、反应时间和温度 阅读提示：Methods: Proteasome stimulating activity assay |
| 结合亲和力测定 | ITC和SPR的蛋白浓度、缓冲液、固定和再生条件 阅读提示：Methods: Isothermal titration calorimetry (ITC) and Surface plasmon resonance (SPR) |
| 蛋白表达与纯化（E. coli） | IPTG浓度、诱导温度和时间、裂解和纯化步骤 阅读提示：Methods: Protein expression and purification in E. coli |