AMPK对TFEB转录活性的影响
验证AMPK激活和MTOR抑制对TFEB靶基因表达的影响
用MK-8722或torin1处理WT和AMPK DKO MEFs，检测TFEB磷酸化及靶基因表达。
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AMPK通过去磷酸化MTORC1依赖性和非依赖性位点促进TFEB转录活性
AMPK promotes TFEB transcriptional activity through dephosphorylation at both MTORC1-dependent and -independent sites.
实验完整度
高结合药理学和遗传学手段（AMPK激活剂/抑制剂、敲除细胞），通过免疫印迹、RT-qPCR、RNA-seq、质谱和DQ-BSA实验进行多层级验证。
主要模型
野生型MEF prkaa1 prkaa2双敲除MEF tfeb tfe3双敲除MEF HEK293细胞
重点核对
AMPK基因敲除细胞系（prkaa1 prkaa2 DKO MEF/HEK293） AMPK激活剂MK-8722浓度（10μM） MTOR抑制剂torin1浓度（100nM） 药物处理时间（1h, 6h） TFEB-GFP敲入MEF用于质谱分析
摘要
转录因子EB（TFEB）是溶酶体生物发生、巨自噬/自噬和能量稳态的关键调节因子，通过控制属于协同溶酶体表达和调节网络的基因表达。据报道，AMP活化蛋白激酶（AMPK）在三个保守的C端丝氨酸残基（S466、S467、S469）上磷酸化TFEB，这些磷酸化事件被认为对TFEB的转录激活至关重要。与该观点截然相反，我们证明AMPK激活导致C端位点的去磷酸化。我们表明，包含TFEB C端丝氨酸残基的合成肽在体外是AMPK的弱底物。用AMPK激活剂（MK-8722）、葡萄糖剥夺或MTOR抑制剂（torin1）处理细胞，不仅使MTORC1靶向的N端丝氨酸位点，而且使C端位点的TFEB发生强烈的去磷酸化。AMPK功能缺失消除了MK-8722而非torin1诱导的去磷酸化和TFEB靶基因的诱导。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AMPK激活是否直接磷酸化TFEB C端丝氨酸位点（S466、S467、S469），以及这些位点的磷酸化状态如何调节TFEB转录活性。
- 核心机制
- AMPK激活导致TFEB C端丝氨酸位点去磷酸化，且该去磷酸化不依赖于MTORC1，AMPK对torin1诱导的TFEB转录激活是非必需的。
- 主要证据
- 使用AMPK激活剂（MK-8722）、抑制剂（BAY-3827）和基因敲除细胞，通过免疫印迹、免疫沉淀、质谱分析显示TFEB C端位点去磷酸化；通过RT-qPCR和RNA-seq显示torin1诱导的TFEB靶基因表达在AMPK敲除细胞中保留。
- 研究意义
- 揭示了AMPK和MTORC1调节TFEB活性的新机制，表明AMPK不直接磷酸化C端位点，可能通过促进去磷酸化发挥作用，对理解细胞能量和营养信号整合具有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析
鉴定依赖TFEB/TFE3和AMPK的基因表达变化
对WT和tfeb tfe3 DKO MEFs及WT和AMPK DKO MEFs进行RNA-seq，分析MK-8722和torin1诱导的基因表达。
溶酶体蛋白酶活性测定
评估AMPK和TFEB对torin1诱导的溶酶体蛋白水解活性的必要性
用DQ-BSA探针检测WT、AMPK DKO和TFEB/TFE3 DKO MEFs在处理后的蛋白水解活性。
C端丝氨酸位点磷酸化检测
验证AMPK激活和MTOR抑制对TFEB C端磷酸化的影响
使用自制的磷酸化位点特异性抗体，通过免疫沉淀和免疫印迹检测不同条件下的TFEB C端磷酸化状态。
体外AMPK活性测定
评估TFEB C端肽段作为AMPK底物的效率
在无细胞体系中，使用重组AMPK和合成肽段进行激酶活性测定。
质谱分析
定量分析TFEB C端丝氨酸磷酸化变化
使用TFEB-GFP敲入MEFs，免疫沉淀后进行质谱分析，量化S467磷酸化水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Invitrogen | 31966 |
| 胎牛血清 | Sigma | F7524 | |
| 细胞处理 | MK-8722 | Glixx Laboratories Inc, MedChemExpress | GLXC-11445, HY-111363 |
| Torin1 | Selleck Chemicals | S2827 | |
| BAY-3827 | MedChemExpress | HY-112083 | |
| 胰岛素样生长因子1 | Thermo Fisher | PHG0071 | |
| 转染 | TransIT-X2动态递送系统 | Mirus | MIR6000 |
| 免疫印迹 | 硝酸纤维素膜 | Sigma | GE10600002 |
| 增强化学发光底物 | Millipore | WBKLS0500 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白G琼脂糖 | Cytiva | 17061802 |
| 体外激酶活性 | 重组人AMPK复合物 | SignalChem Biotech | P47-110GH |
| RNA测序 | QIAwave RNeasy试剂盒 | QIAGEN | 74536 |
| Universal Plus mRNA-seq方案 | Tecan Life Sciences | 0520 | |
| NovaSeq 6000 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | Superscript III cDNA合成试剂盒 | Invitrogen | 18080 |
| PrecisionPLUS qPCR预混液（含SYBRgreen） | Primer Design | Z_PPLUS-SY-20ml | |
| 流式细胞术 | DQ Red牛血清白蛋白 | Invitrogen | D12051 |
| CytoFLEX S流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 免疫沉淀-质谱 | GFP-Trap琼脂糖珠 | ChromoTek | gta |
| 免疫荧光 | Zeiss LSM880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞处理 | MK-8722浓度（10μM）、torin1浓度（100nM）、处理时间（1h、6h） 阅读提示：见Figure 1B,C, Figure 3B |
| 免疫沉淀 | 抗体（TFEB Proteintech 13372-1-AP, Abcam ab267351）、蛋白量（0.5-1mg）、孵育时间（16h） 阅读提示：见Materials and methods - Immunoprecipitation |
| 免疫印迹 | 一抗稀释比例（1:1000等）、二抗种属 阅读提示：见Materials and methods - Western blotting |
| 激酶活性测定 | 重组AMPK浓度、肽段浓度（200μM）、ATP浓度（100μM） 阅读提示：见Materials and methods - In vitro AMPK activity assay |
| RNA-seq分析 | 差异表达阈值（FC≥1.2, FDR<0.05）、参考基因组版本 阅读提示：见Materials and methods - RNA sequencing and bioinformatic analysis |