蛋白表达与纯化
获得高纯度、构象均一的hPROT蛋白用于结构解析
使用BacMam系统在293F细胞中表达hPROT，经DDM/CHS或DDM单独增溶，通过Strep-Tactin亲和纯化和凝胶过滤纯化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
人脯氨酸转运蛋白的转运机制与胆固醇调控的结构基础
Structural basis for the transport mechanism and cholesterol modulation of the human proline transporter.
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析、转运动力学测定、点突变功能验证、胆固醇耗竭实验等多个证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
293F细胞表达的人PROT蛋白 hPROT脂质体（未明确说明，但冷冻电镜样品为纯化蛋白）
重点核对
hPROT在293F细胞中的表达体系（BacMam病毒） L-脯氨酸摄取实验的底物浓度范围0-320μM MβCD处理浓度3.5mg/mL及处理时间30min 点突变如Y133A、F303W、F403L对转运活性的影响
摘要
L-脯氨酸是一种氨基酸，在中枢神经系统中作为有效的神经调质发挥作用，其突触浓度由高亲和力L-脯氨酸转运蛋白（PROT）精细调节。PROT功能失调与神经精神疾病相关，但其调控机制仍不清楚。在此，我们展示了人PROT在无L-脯氨酸共有状态和L-脯氨酸结合状态下的高分辨率冷冻电镜结构。L-脯氨酸结合结构揭示了一种封闭构象，详细展示了底物和离子的配位。引人注目的是，我们的无L-脯氨酸共有结构捕获了一种内向开放构象，其中胆固醇分子直接结合在底物结合位点内。转运动力学研究表明，部分胆固醇耗竭可提高PROT对L-脯氨酸的表观亲和力，证实胆固醇抑制L-脯氨酸摄取。此外，我们识别了一个构象敏感位点（CHOL1'），仅存在于内向开放构象中。这项工作阐明了PROT的转运循环，并展示了胆固醇如何直接调节神经递质摄取，为脑疾病提供了潜在的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人脯氨酸转运蛋白PROT如何识别底物L-脯氨酸，以及胆固醇如何调控其转运功能？
- 核心机制
- 胆固醇直接结合于PROT底物结合位点（CHOL0位点），作为正构抑制剂竞争性抑制L-脯氨酸摄取；此外，内向开放构象特异性存在的CHOL1'位点可能影响构象动态。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构显示胆固醇占据底物结合位点；动力学分析显示胆固醇耗竭降低Km但不改变Vmax；点突变S238F、A402F、F309W模拟胆固醇耗竭的低Km表型；且突变后MβCD处理不再影响Km。
- 研究意义
- 揭示胆固醇直接调控神经递质转运的新机制，为治疗精神疾病、中风等脑疾病提供潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜结构解析
确定hPROT在无底物和结合L-脯氨酸状态下的三维结构
制备L-脯氨酸结合（10mM L-脯氨酸孵育）和未结合样品，进行冷冻电镜数据采集和处理，得到不同构象的结构。
底物识别机制验证
验证结构中预测的关键氨基酸残基对底物结合和转运功能的作用
构建底物结合位点残基突变（如Y53A、Y133A、F303W、F403L等），通过[3H]脯氨酸摄取实验评估突变体的转运活性。
胆固醇调控功能验证
验证胆固醇结合对hPROT转运活性的影响
使用MβCD处理细胞耗竭胆固醇，测量胆固醇水平变化，并进行[3H]脯氨酸摄取动力学分析；同时构建阻塞CHOL0位点的突变体（S238F、A402F、F309W）检测其表型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 293F细胞 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白表达 | Bac-to-Bac系统 | -- | -- |
| 蛋白纯化 | 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷 | Anatrace | -- |
| 胆固醇半琥珀酸酯 | Anatrace | -- | |
| Strep-Tactin 4FF柱 | Smart-Lifesciences | -- | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Cytiva | -- | |
| 100 kDa截留分子量离心浓缩管 | Millipore | -- | |
| 胆固醇处理 | 甲基-β-环糊精 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胆固醇定量 | Amplex Red胆固醇检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 冷冻电镜样品制备 | 微栅金网（GIG Au 300目，R 1.0/1.0） | GIG | -- |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 冷冻电镜数据采集 | Titan Krios透射电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| K3 Summit直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| 量子能量过滤器 | Gatan | -- | |
| 冷冻电镜数据处理 | cryoSPARC-4.7.0 | -- | -- |
| RELION-4.0.1 | -- | -- | |
| 模型构建 | AlphaFold3 | -- | -- |
| UCSF ChimeraX | -- | -- | |
| Coot-0.9.8.9 | -- | -- | |
| PHENIX-1.20.1 | -- | -- | |
| 功能分析 | GraphPad Prism 8 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达 | 293F细胞密度、感染时间、丁酸钠浓度、表达持续时间 阅读提示：见Methods部分“Protein expression and purification” |
| 蛋白纯化 | 增溶去垢剂类型及浓度（DDM/CHS是否添加）、缓冲液组成、纯化步骤 阅读提示：见Methods部分“Protein expression and purification” |
| 冷冻电镜样品制备 | 蛋白浓度、L-脯氨酸孵育浓度和时间、网格类型、冰厚度 阅读提示：见Methods部分“EM sample preparation” |
| 胆固醇处理 | MβCD浓度、处理时间、处理温度，以及胆固醇耗竭效率 阅读提示：见Methods部分“Cholesterol manipulation and quantification” |
| 摄取动力学 | 底物浓度范围、孵育时间、细胞密度、检测方法 阅读提示：见Methods部分“[3H]proline uptake and kinetic assays” |