Structure of the human P2X3 receptor reveals the basis for subtype-selective inhibition by sivopixant.
包括冷冻电镜结构解析、基于结构的突变分析（电生理）、功能获得性突变验证、分子动力学模拟等多个独立证据层级。
人P2X3受体（异源表达于Sf9昆虫细胞） HEK293细胞（异源表达人P2X1、P2X2、P2X3受体及其突变体）
cryo-EM结构：人P2X3受体与sivopixant和ATP复合物 电生理记录：全细胞膜片钳和穿孔膜片钳 分子动力学模拟
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定人P2X3受体与sivopixant和ATP结合的精确三维结构，以揭示sivopixant的结合位点和结合模式。
使用Sf9昆虫细胞表达人P2X3受体，经纯化后与sivopixant和ATP孵育，通过冷冻电镜单颗粒分析解析了两种结构：sivopixant-ATP结合结构（3.34 Å）和仅ATP结合结构（2.95 Å）。结构显示sivopixant结合在胞外结构域上体区的别构位点。
验证sivopixant结合位点中关键残基对其抑制功能的影响。
对结合位点残基进行突变（M75A、M75W、T82I、P84A、Q85A、M96A、M96W、M165A、M165W、F282A、F282W、Y285W、L298F），并通过膜片钳记录检测突变体对sivopixant抑制的敏感性变化。
确定sivopixant对P2X3亚型选择性的关键残基。
通过结构叠加比较人P2X3与P2X1、P2X2、P2X4、P2X7的结构，结合序列比对，识别出五个关键残基（Asp79、Thr82、Met96、Met165、Tyr285）。利用AlphaFold3预测P2X2/P2X3异聚体结构，并设计功能获得性突变体（hP2X1-GOF和hP2X2-GOF）以验证这些残基的作用。
揭示sivopixant抑制P2X3受体通道开放的分子机制。
将sivopixant-ATP结合结构与人P2X3受体的apo闭合态（PDB: 5SVJ）和ATP开放态（PDB: 5SVK）结构比较，并结合MD模拟分析sivopixant结合后上体结构域的运动。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | pFastBac载体 | -- | -- |
| 蛋白表达 | SIM SF培养基 | Sino Biological | -- |
| 转染 | FuGENE HD转染试剂 | Promega | -- |
| 蛋白纯化 | 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷 (DDM) | Anatrace | -- |
| 腺苷三磷酸双磷酸酶 | Sigma | -- | |
| Streptactin Beads 4FF亲和纯化树脂 | Smart-Lifesciences | -- | |
| Superdex 200 Increase 5/150 GL尺寸排阻色谱柱 | Cytiva | -- | |
| 月桂基麦芽糖新戊二醇 (LMNG) | Anatrace | -- | |
| 蛋白浓缩 | Amicon Ultra 50 kDa截留超滤管 | Merck Millipore | -- |
| cryo-EM样品制备 | Sivopixant | MedChemExpress | -- |
| Quantifoil微栅碳膜载网 | Quantifoil | -- | |
| Vitrobot快速冷冻仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| cryo-EM数据收集 | Falcon 4i相机 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Titan Krios冷冻电镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 电生理 | pEGFP-N1载体 | -- | -- |
| KOD-Plus-突变试剂盒 | TOYOBO | -- | |
| Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM） | Gibco | -- | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | -- | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | -- | |
| 磷酸钙转染试剂 | -- | -- | |
| 制霉菌素 | Sangon Biotech | -- | |
| Axopatch 200B放大器 | Molecular Devices | -- | |
| pCLAMP 10软件 | Molecular Devices | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | 表达系统（Sf9细胞）、培养温度（27°C）、感染时间（60小时）、纯化缓冲液成分（TBS、DDM浓度等） 阅读提示：Methods: Protein expression and purification |
| cryo-EM结构解析 | sivopixant浓度（0.1 mM）、网格类型（Quantifoil Au R1.2/1.3）、显微镜参数（300 kV，放大倍数130,000×，总剂量40 e-/Ų，像素大小0.959 Å） 阅读提示：Methods: Cryo-EM data acquisition, Cryo-EM data processing |
| 电生理记录 | 细胞系（HEK293）、转染时间（36小时）、记录方法（全细胞、穿孔）、sivopixant浓度（1 μM、0.3 μM）、ATP浓度（0.1、1、10 μM）、钳制电压（-60 mV） 阅读提示：Methods: Electrophysiology, Figure legends for Figure 3 and 5 |
| 突变分析 | 突变列表（M75A等）、突变引入方法（KOD-Plus-Mutagenesis Kit）、测序验证 阅读提示：Methods: Electrophysiology, Results: Structure-based mutational analysis |
| MD模拟 | 起始模型（四种）、力场（OPLS 2005）、膜模型（POPC）、模拟时间（~0.5 μs）、温度（300 K）、盐浓度（150 mM NaCl） 阅读提示：Methods: Molecular dynamics (MD) simulations, Figure 7 legend |
