circRNA设计与体外表达验证
验证circRNA能否表达融合抗原并保留关键表位
设计了circVB16T13，通过Sanger测序和RNase H消化验证环化；在HEK293T和A549细胞中检测表达和翻译持续性；通过SPR检测糖基化对抗原表位的影响。
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一种环状RNA疫苗在小鼠中诱导针对B群脑膜炎奈瑟菌的持久和交叉保护性免疫
A circular RNA vaccine induces durable and cross-protective immunity against Neisseria meningitidis serogroup B in mice.
实验完整度
高包含体外细胞表达与表位分析、小鼠免疫原性与攻毒保护实验、被动转移实验等多层级验证，并明确功能验证和机制验证。
主要模型
6周龄雌性BALB/c小鼠 ICR (CD-1) 远交系小鼠 7日龄Wistar大鼠幼崽 HEK293T、A549、NIH 3T3、Expi293F细胞系
重点核对
circRNA纯化：RNase R消化和SEC，纯度90.7% (CE)和71.1% (CGE-LIF) BALB/c小鼠免疫剂量：15 μg或30 μg circRNA-LNP，肌肉注射，三剂，间隔2周 攻毒模型：MC58菌株2×10^6 CFU腹腔注射，感染前16小时肌肉注射10 mg铁葡聚糖 SBA分析：使用人补体，起始稀释度1:4，血清56°C灭活30分钟 CD8+ T细胞耗竭：抗CD8α抗体200 μg/只，攻毒前第-3天和-1天腹腔注射
摘要
B群脑膜炎奈瑟菌（MenB）仍然是全球脑膜炎和败血症的主要原因。然而，MenB疫苗的开发受到抗原多样性和资源有限环境中与外膜囊泡（OMV）或脂蛋白相关的制造挑战的阻碍。在此，我们设计了一种高纯度环状RNA（circRNA）疫苗，编码一种源自细菌的、序列优化的因子H结合蛋白（fHbp）和脑膜炎奈瑟菌肝素结合抗原（NHBA）融合抗原（fHbp-NHBA），该抗原在真核系统中保留了关键的杀菌表位。该疫苗通过使用人补体的血清杀菌试验（SBA）引发了有效的功能性抗体反应，并引发了有效的分泌IFN-γ的CD8+ T细胞反应。至关重要的是，低剂量的circRNA疫苗提供了完全保护，并减少了针对致死性MenB攻击的菌血症，并显示出针对中国一组流行菌株的交叉保护。单剂量和两剂量方案的circRNA疫苗均诱导了持久的免疫反应，两剂量免疫实现的菌株覆盖率与已许可的MenB疫苗相当。此外，从circRNA免疫组转移的血清到新生大鼠幼崽中可显著降低血液中的细菌载量。这项研究为基于circRNA的针对细菌病原体的疫苗奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circRNA疫苗能否表达细菌源性fHbp-NHBA融合抗原并诱导针对MenB的保护性免疫？
- 核心机制
- circRNA疫苗通过LNP递送表达融合抗原，诱导功能性抗体（SBA）和IFN-γ+ CD8+ T细胞反应，功能性抗体是主要保护机制。
- 主要证据
- 低剂量circVB16T13（15 μg）在BALB/c小鼠中提供100%保护，减少菌血症；血清被动转移至大鼠幼崽可降低细菌载量。
- 研究意义
- 该研究为基于circRNA的细菌疫苗开发奠定了基础，可能用于MenB及其他细菌病原体。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠免疫原性评估
评估circRNA疫苗诱导的体液和细胞免疫反应
BALB/c小鼠免疫三剂circRNA-LNP或蛋白疫苗，检测血清抗体滴度、SBA滴度、IgG亚类、Tfh和GC B细胞频率、细胞因子分泌。
致死性攻毒保护实验
评估circRNA疫苗对致死性MC58攻击的保护效果
在攻击前用铁葡聚糖处理，腹腔注射MC58，监测菌血症和存活率，进行组织病理学检查。
交叉保护性评估
评估circRNA疫苗对中国流行菌株的杀菌活性
使用三剂免疫的BALB/c小鼠血清和两剂免疫的CD-1小鼠血清，对18株菌株和7株菌株进行hSBA检测，并与许可疫苗比较。
持久性和被动转移实验
评估免疫反应的持久性及血清的保护性转移
单剂或两剂免疫CD-1小鼠，检测SBA滴度至24周；将免疫小鼠血清被动转移至大鼠幼崽，攻击后检测菌血症。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| circRNA制备 | 核糖核酸酶R | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| SMM 293-TII表达培养基 | SinoBiological | -- | |
| 细菌培养 | 血琼脂平板 | HuanKai Microbial | -- |
| SBA | Hanks平衡盐溶液 | Gibco | -- |
| 人补体 | Pel-Freez | -- | |
| 攻毒实验 | 铁葡聚糖 | -- | -- |
| CD8+T细胞耗竭 | 抗CD8α抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| circRNA制备与纯化 | RNase R消化条件、SEC条件、纯度标准（CE和CGE-LIF） 阅读提示：材料与方法部分和S1C Fig |
| 细胞转染与表达 | 细胞系、转染剂量（1 μg）、检测时间点（24-96小时） 阅读提示：Results 的“circRNA robustly expressed...”部分和S2D Fig |
| 免疫原性实验 | 小鼠品系和性别、周龄、每组数量（n=5）、免疫剂量（15或30 μg circRNA；20 μg蛋白）、免疫途径（肌注或皮下）、间隔（2周）、佐剂使用 阅读提示：Materials and methods 的 Immunization 部分和Fig 3A |
| 攻毒保护实验 | 攻毒菌株（MC58）、攻毒剂量（2×10^6 CFU）、攻毒途径（腹腔）、铁葡聚糖剂量（10 mg）和时间（攻毒前16小时）、监测时间点 阅读提示：Materials and methods 的 Challenge assay 部分和S7 Fig |
| SBA分析 | 血清起始稀释度（1:4）、人补体稀释度（1:4）、细菌浓度（1.25×10^4 CFU/mL）、孵育条件（37°C，65 rpm，1小时） 阅读提示：Materials and methods 的 Serum bactericidal assay 部分 |
| 被动转移实验 | 大鼠品系（Wistar）、日龄（7天）、血清转移体积和稀释度（1:10）、攻毒剂量（1×10^6 CFU）、采血时间（3小时） 阅读提示：Materials and methods 的 Passive transfer 部分（原文未明确，可查Table 4） |