KLHL41配体的虚拟筛选
鉴定靶向KLHL41的潜在小分子配体
使用AlphaFold2预测KLHL41结构，COACH-D预测结合位点，通过AutoDock-GPU、Glide SP和Glide XP多级对接筛选Enamine Hit Locator Library，并进行ABFE模拟，最终选出34个命中化合物。
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发现用于肌肉特异性蛋白降解的KLHL41配体
Discovery of a KLHL41 Ligand for Muscle Specific Protein Degradation.
实验完整度
高包含虚拟筛选、CETSA、光亲和标记、BLI、细胞系功能验证、体内动物实验及定量蛋白质组学等多层级证据。
主要模型
RH30人横纹肌肉瘤细胞系 RD人横纹肌肉瘤细胞系 C2C12小鼠成肌细胞分化模型 C57BL/6小鼠体内模型
重点核对
EN10与KLHL41的结合：通过CETSA和光亲和标记验证 KBD-1和cKBD-1诱导BRD4降解的浓度和时间依赖性 KLHL41依赖性：通过siRNA敲低和过表达实验验证 体内实验中cKBD-1的给药途径和剂量（IV/IP，5 mpk）
摘要
尽管PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）的开发最近取得了进展，但它们仍主要依赖于两种在所有细胞类型中普遍表达的E3连接酶CRBN和VHL。近年来，发现组织特异性E3连接酶配体的努力作为实现组织特异性蛋白降解并避免脱靶组织效应的有前景的策略而受到关注。推进这一研究方向，我们通过虚拟筛选发现了肌肉特异性E3连接酶KLHL41的配体。基于KLHL41配体，我们开发了KBD-1，一种具有微摩尔活性的肌肉特异性BRD4靶向PROTAC。为了提高降解效率，我们采用了两体动力学策略，产生了共价PROTAC cKBD-1，其实现了亚纳摩尔活性。cKBD-1在体外和体内均通过KLHL41募集展示了肌肉特异性的BRD4降解。此外，KLHL41配体使得靶向AR的PROTAC的开发成为可能，证明了其广泛的适用性。这些发现强调了KLHL41作为组织特异性蛋白降解平台的潜力及其在治疗开发中的适用性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何发现肌肉特异性E3连接酶KLHL41的配体，并开发肌肉特异性PROTAC以实现组织特异性蛋白降解？
- 核心机制
- cKBD-1通过共价结合KLHL41的Cys593，利用KLHL41招募BRD4，通过CRL介导的泛素化和蛋白酶体降解实现肌肉特异性蛋白降解。
- 主要证据
- CETSA和光亲和标记验证EN10与KLHL41结合；KBD-1/cKBD-1在RH30细胞中诱导BRD4降解，被MG132或MLN4924抑制，且在KLHL41敲低细胞中减弱；C2C12分化和体内实验证实肌肉特异性。
- 研究意义
- KLHL41作为肌肉特异性E3连接酶平台，为肌肉相关疾病如肌营养不良和肉瘤的精准治疗提供潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CETSA验证KLHL41配体
验证候选化合物与KLHL41的细胞内结合
在RH30细胞中用20 μM候选化合物处理，加热变性，通过Western blot检测KLHL41热稳定性变化。EN10显示热位移。
EN10衍生物和探针验证
优化连接位置并确认EN10靶点
合成EN10衍生物（EN10-L1-L4）和光亲和探针EN10-DA，通过CETSA和pulldown实验验证结合，并确认对KLHL41的选择性。
KBD系列PROTAC的开发和活性评估
开发KLHL41-based BRD4降解剂并评估其活性
合成KBD-1至KBD-5，连接EN10和JQ1，检测BRD4降解。KBD-1在RH30细胞中20 μM完全降解BRD4，机制研究显示依赖CRL和蛋白酶体。
验证KLHL41依赖性和肌肉细胞特异性
验证PROTAC活性依赖于KLHL41，且仅在肌肉细胞中有效
在RD、RH30（肌肉瘤）和OV90、A549、SW480、HeLa（非肌肉）细胞中检测BRD4降解和细胞毒性，并通过siRNA敲低和过表达验证依赖性。
tPROTAC策略开发
提高PROTAC降解效率
通过引入α-氯乙酰基合成共价EN10（cEN10）和cKBD系列，检测BRD4降解，cKBD-1的DC50为0.64 nM。
cKBD-1在体外和体内的肌肉特异性验证
验证cKBD-1在细胞和动物水平上的肌肉特异性BRD4降解
在六个细胞系中检测cKBD-1的BRD4降解和细胞毒性，C2C12分化模型，并通过体内实验（IV/IP注射）验证肌肉特异性降解。
cKBD-1结合位点和动力学分析
确定cKBD-1的共价结合位点和与BRD4相互作用的动力学常数
质谱鉴定cKBD-1修饰KLHL41的Cys593，BLI测定KLHL41/cKBD-1与BRD4的KD为27.04 nM。
定量蛋白质组学分析
评估cKBD-1的降解选择性
TMT标记定量蛋白质组学分析RH30细胞中DMSO或10 nM cKBD-1处理后的蛋白组变化，确认BRD4减少，其他溴结构域蛋白不变。
药代动力学分析
评估cKBD-1的药物代谢特性
在大鼠中静脉注射5 mg/kg cKBD-1，测定半衰期2.5 h，分布容积1.44 L/kg。
AR靶向PROTAC开发
验证KLHL41配体在其它靶蛋白上的适用性
合成KAD系列（EN10连接AR拮抗剂），检测AR降解，KAD-1在30 μM完全降解，cKAD-1 DC50为202.2 nM。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Welgene | LM011-01 |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | #16000-044 | |
| 马血清 | Gibco | #16050-130 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | #12605-010 | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | CK04-13 |
| 免疫印迹 | PVDF膜 | Merck | IPVH00010 |
| 抗KLHL41抗体 | Novusbio | NBP1-80787 | |
| 抗BRD4抗体 | CST | #13440S | |
| 抗GAPDH抗体 | CST | #2118S | |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | #13778-150 |
| Lipofectamine LTX Plus转染试剂 | Invitrogen | #15338-100 | |
| 点击化学 | 生物素-PEG4-吡啶甲基叠氮化物 | Broadpharm | BP-22954 |
| 蛋白质纯化 | Ni-NTA琼脂糖珠 | Qiagen | #30210 |
| Superdex 200色谱柱 | Cytiva | GE17-5175-01 | |
| 生物层干涉法 | NTA生物传感器 | Sartorius | #18-5101 |
| SA生物传感器 | Sartorius | #18-5019 | |
| 质谱分析 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| TMT标记试剂 | Thermo | A44520 | |
| EasyPep Mini样品制备试剂盒 | Thermo | A40006 | |
| 体内实验 | 聚乙二醇400 | TCI | N0433 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 虚拟筛选 | KLHL41结构模型来源、筛选库来源、对接软件及参数 阅读提示：Methods: Virtual KLHL41 ligand screening |
| CETSA | 细胞系、化合物浓度、处理时间、加热温度 阅读提示：Methods: Cellular thermal shift assay |
| PROTAC处理 | 细胞系、处理浓度、处理时间、抑制剂共处理 阅读提示：Results: Fig. 3 and Fig. 4 legends |
| siRNA敲低 | siRNA序列、转染试剂、处理时间 阅读提示：Methods: siRNA transfection |
| 体内实验 | 动物品系、周龄、性别、给药途径、剂量、处理时间 阅读提示：Methods: In vivo cKBD-1 treatment |