BPA提取与化学成分分析
获得BPA提取物并鉴定其主要化学成分,作为后续体外和体内实验的干预物。
通过冷浸、萃取和柱色谱从鬼针草全草中制备BPA,并通过HPLC分析鉴定主要化合物1-8(黄酮类和多炔类)。
Cancer Immunomodulatory Effect of Bidens pilosa L. in Mice: Suppression of Tumor-Associated Macrophages and Regulatory T Cells.
包含体外细胞分化与功能实验、动物移植瘤模型、分子表达检测(qRT-PCR/Western blot)及转录组测序等多层级证据,且具有功能与机制验证。
CT26.WT小鼠同基因结直肠癌模型 小鼠腹腔巨噬细胞(M0/M1/M2) 小鼠原代CD4+ T细胞及诱导Tregs
BPA给药剂量(50或100 mg/kg)及5-FU剂量(30 mg/kg) BPA及化合物1、3的体外处理浓度(12.5-50 μM或μg/mL) M2巨噬细胞极化诱导因子(IL-4/IL-13浓度) Tregs分化诱导因子(TGF-β、IL-2、rapamycin等浓度) 小鼠肿瘤体积测量与分组(n=6)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获得BPA提取物并鉴定其主要化学成分,作为后续体外和体内实验的干预物。
通过冷浸、萃取和柱色谱从鬼针草全草中制备BPA,并通过HPLC分析鉴定主要化合物1-8(黄酮类和多炔类)。
评估BPA及其化合物对M2-TAMs和Tregs分化的抑制作用及对CD4+ T细胞增殖的影响。
从小鼠腹腔分离巨噬细胞并用IL-4/IL-13诱导M2极化;从淋巴结和脾脏分离naïve CD4+ T细胞并诱导Tregs。用BPA或化合物处理,通过流式细胞术检测M2(CD206+F4/80+)和Tregs(CD25+Foxp3+)比例;通过CFSE标记分析CD4+ T细胞增殖。
验证BPA在体内的抗肿瘤效果及其安全性。
将CT26.WT细胞皮下接种至BALB/c小鼠,建立同基因结肠癌模型。当肿瘤体积达到50-100 mm³时,随机分组并给予BPA、5-FU或联合治疗。测量肿瘤体积和体重,并通过ELISA检测血清IL-10、IHC检测Ki67、H&E染色评估组织毒性。
检测BPA处理对肿瘤组织中TAMs和Tregs相关基因和蛋白表达的影响。
通过qRT-PCR检测肿瘤组织中M2-TAMs和Tregs相关促肿瘤因子(Arg-1、YM-1、CCL2等)和抑瘤因子(TNF-α、IL-1β等)的mRNA水平;通过Western blot检测相关蛋白(CD206、Foxp3、CD25、PD-1、PD-L1、CD80、CD4、GITR)表达。
阐明BPA调节M2-TAMs和Tregs分化的潜在分子机制。
对BPA处理的M2巨噬细胞和Tregs进行RNA-seq,鉴定差异表达基因并进行KEGG通路富集分析。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Biological Industries | C3113-0500 |
| 胎牛血清 | VivaCell | C04001-500 | |
| 谷氨酰胺 | Biological Industries | E607004-0500 | |
| RPMI 1640培养基 | Biological Industries | C3010-0500 | |
| 青霉素-链霉素 | Sangon Biotech | E607011-0100 | |
| 白细胞介素-4 | PeproTech | 214-14 | |
| 白细胞介素-13 | Sino Biological Inc. | 50225-MNAH | |
| 脂多糖 | Sigma | 93572-42-0 | |
| 细胞分选 | EasySep小鼠初始CD4+ T细胞分选试剂盒 | Stemcell Technologies | 19765 |
| Treg分化 | 抗CD3e抗体 | eBioscience | 16-0031-82 |
| 抗CD28抗体 | eBioscience | 16-0281-82 | |
| 抗IL-4单克隆抗体 | eBioscience | 16-7041-81 | |
| 抗IFN-γ抗体 | eBioscience | 16-7311-85 | |
| 白细胞介素-2 | Sino Biological Inc. | 51061-MNAE | |
| 转化生长因子-β | Sino Biological Inc. | 51061-MNAE | |
| 雷帕霉素 | Sigma | S115842 | |
| 动物实验 | 5-氟尿嘧啶 | MCE | HY-90006 |
| 细胞活力检测 | MTT | Macklin | 298-93-1 |
| 流式细胞术 | 抗CD16/32抗体 | Elabscience | E-AB-F0997A |
| PerCP/Cyanine5.5抗小鼠F4/80抗体 | Elabscience | E-AB-F0995J | |
| FITC抗小鼠CD206抗体 | Elabscience | E-AB-F1135C | |
| APC抗小鼠CD80抗体 | Elabscience | E-AB-F0992E | |
| APC抗小鼠CD25抗体 | Elabscience | E-AB-F1102E | |
| 转录因子缓冲液套装 | BD Biosciences | 562574 | |
| PE抗小鼠Foxp3抗体 | Elabscience | E-AB-F1238D | |
| qRT-PCR | 总RNA提取试剂盒(Trizol) | TaKaRa | 9109 |
| 逆转录试剂盒 | Vazyme | R223-01 | |
| T细胞增殖实验 | CFSE染料 | MCE | HY-D0938 |
| ELISA | 小鼠IL-10 ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10008 |
| H&E染色 | 中性树脂 | Solarbio | G8590 |
| 免疫组化 | 抗Ki67一抗 | Proteintech | 28074-1-AP |
| HRP聚合物标记二抗 | ZSGB-BIO | PV-6001 | |
| DAB显色试剂 | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 山羊血清 | Solarbio | SL038 | |
| 牛血清白蛋白 | Coolaber | CA1381 | |
| Western blot | 裂解缓冲液 | -- | -- |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BPA制备 | BPA提取批次、HPLC图谱、主要成分含量 阅读提示:2.2节及图1 |
| 细胞培养与极化 | 细胞系来源、培养基、诱导因子浓度与时间 阅读提示:2.3节、2.4.1节及图S1-S4 |
| Tregs分化 | naïve CD4+ T细胞纯度、细胞因子和抗体浓度、孵育时间 阅读提示:2.4.2节及图S2 |
| 动物模型 | 小鼠品系、周龄、性别、细胞接种数量、给药剂量、频率、途径、分组、样本量 阅读提示:2.4.3节 |
| 体内检测 | 血清IL-10水平、Ki67表达、mRNA和蛋白检测条件 阅读提示:2.9-2.12节及图5、图6 |
| RNA-seq | 文库构建、测序平台、差异表达分析参数 阅读提示:2.13节及图7 |