S-2P免疫原性评估
评估鼻内接种S-2P与肌肉接种相比诱导全身和黏膜体液免疫的能力
C57BL/6小鼠分别经鼻内和肌肉接种10 μg S-2P，检测血清和BALF中RBD特异性抗体及中和抗体。
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鼻内给予S-2P与香菇多糖制剂通过IFN-γ主导机制对SARS-CoV-2关切变异株提供广泛保护
Intranasal S-2P and lentinan formulation confers broad protection against SARS-CoV-2 VOCs via IFN-γ-dominant mechanisms.
实验完整度
高包含体外BMDM/BMDC刺激实验、多种基因敲除小鼠模型、K18-hACE2小鼠致死攻击模型、T细胞耗竭及IFN-γ中和实验，功能与机制验证完整。
主要模型
C57BL/6小鼠 K18-hACE2转基因小鼠 骨髓来源巨噬细胞（BMDM）与树突状细胞（BMDC） Vero E6细胞
重点核对
鼻内免疫剂量为10 μg S-2P，LNT剂量为200 μg，铝佐剂剂量为100 μg 免疫方案为第0、21天（部分实验第112天加强） 病毒攻击剂量：祖先株10 PFU，Omicron BA.5为1000 PFU，EG.5为10 PFU T细胞耗竭使用抗CD8α（200 μg）和抗CD4（200 μg）抗体静脉注射 IFN-γ中和使用250 μg抗IFN-γ抗体静脉注射
摘要
有效的呼吸道黏膜疫苗仍是缓解SARS-CoV-2快速突变和传播的迫切需求。在此，我们证明了祖先SARS-CoV-2的刺突蛋白（S-2P）作为鼻内免疫的自佐剂抗原，通过整合素和STING依赖途径诱导强大的全身和黏膜免疫。相比之下，H1N1流感血凝素（HA）在鼻内免疫后未能产生可测量的血清IgG或黏膜IgA。在小鼠中，鼻内S-2P疫苗接种对致死性祖先SARS-CoV-2攻击提供完全保护，并对异源Omicron变异株提供部分交叉保护，这两种效果均依赖IFN-γ和CD8+ T细胞。S-2P与临床免疫调节剂香菇多糖（LNT）联合给药对Omicron变异株实现完全保护，该保护由IFN-γ介导，但基本不依赖CD8+ T细胞。这些发现确立S-2P+LNT作为针对新出现SARS-CoV-2变异株的安全、广谱黏膜疫苗候选，并揭示了超越中和抗体和T细胞免疫的新型保护机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鼻内接种无佐剂的SARS-CoV-2刺突蛋白能否诱导黏膜和全身免疫并提供对关切变异株的保护，以及LNT能否增强其保护效果并揭示其机制。
- 核心机制
- S-2P通过整合素和STING依赖性途径激活固有免疫，诱导I型干扰素相关基因表达，进而促进适应性免疫；LNT作为β-葡聚糖通过激活I型干扰素信号增强免疫应答，并依赖于IFN-γ，但部分不依赖CD8+ T细胞。
- 主要证据
- 在K18-hACE2小鼠中，鼻内S-2P免疫对祖先株提供完全保护，对Omicron提供部分保护；S-2P+LNT提供完全保护。T细胞耗竭实验显示CD8+ T细胞是S-2P保护所必需，但S-2P+LNT在CD8+ T细胞耗竭后仍保留60%存活。IFN-γ中和实验显示消除保护效果。
- 研究意义
- 提出S-2P+LNT作为安全广谱的黏膜疫苗候选，为针对新出现变异株的呼吸道黏膜疫苗开发提供新策略，并揭示了除中和抗体和T细胞免疫之外的保护机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LNT佐剂活性评估
评估LNT作为黏膜佐剂增强S-2P免疫原性的能力
C57BL/6小鼠鼻内接种S-2P+LNT或其他TLR激动剂，比较抗体滴度；转录组分析LNT刺激后肺组织基因表达。
体内保护效力评估
评估鼻内S-2P免疫对祖先株和Omicron变异株攻击的保护效果
K18-hACE2小鼠免疫后，分别用祖先株、BA.5和EG.5攻击，监测存活率、体重变化、病毒载量和组织病理。
免疫机制研究
确定S-2P和S-2P+LNT保护作用所依赖的免疫细胞和细胞因子
用抗CD4、抗CD8或抗IFN-γ抗体处理免疫小鼠，然后攻击Omicron BA.5，监测存活和体重。
自佐剂机制探索
探索S-2P激活固有免疫的分子机制
转录组分析S-2P处理的CLN、BMDM和BMDC；用Sting-/-、Tlr4-/-、Tlr2-/-、Cd209-/-小鼠评估抗体应答；用整合素抑制剂处理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 非必需氨基酸 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EX-CELL™ 325 PF CHO无血清培养基 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 蛋白质制备 | S-2P蛋白 | -- | -- |
| HA蛋白 | Sino Biological | 40668-V08H | |
| 疫苗配制 | 香菇多糖 | MCE | HY-N6653 |
| 铝佐剂 | Croda | -- | |
| ELISA | 山羊抗小鼠IgG-HRP | Invitrogen | -- |
| 山羊抗小鼠IgA-HRP | Southern Biotech | -- | |
| 1-Step™ Slow TMB底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ELISA终止液 | Solarbio | -- | |
| ELISpot | MSIP 96孔板 | Mabtech | -- |
| 链霉亲和素-碱性磷酸酶 | Mabtech | -- | |
| BCIP/NBT-plus底物 | Mabtech | -- | |
| 流式分析 | FITC偶联抗CD3ε抗体 | BioLegend | -- |
| PerCP/Cyanine5.5偶联抗CD4抗体 | BioLegend | -- | |
| APC/Fire™ 750偶联抗CD8α抗体 | BioLegend | -- | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol™试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript™ RT预混液 | TaKaRa | -- | |
| TB Green® Premix Ex Taq™ II | TaKaRa | -- | |
| RNA-seq | Universal RNA提取试剂盒 | ONREW | RNC643 |
| VVAHTS® Universal V8 RNA-seq文库制备试剂盒 | Vazyme | NR605-0 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 组织消化 | 胶原酶D | Roche | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | -- | |
| 红细胞裂解液 | Invitrogen | -- | |
| 中和实验 | SARS-CoV-2核衣壳抗体 | Sino Biological | -- |
| Alexa Fluor 488偶联山羊抗兔IgG抗体 | Invitrogen | -- | |
| DAPI染料 | -- | -- | |
| 动物实验 | 抗CD8α抗体（克隆53-6.7） | BioXCell | -- |
| 抗CD4抗体（克隆YTS 191） | BioXCell | -- | |
| 抗IFN-γ抗体（克隆XMG1.2） | BioXCell | -- | |
| 组织病理 | Pannoramic 250FLASH玻片扫描仪 | 3DHISTECH | -- |
| ELISA | 酶标仪 | BioTek | -- |
| ELISpot | S6超免疫斑点读取器 | Cellular Technology Ltd. | -- |
| 蛋白质鉴定 | 兔抗RBD多克隆抗体 | Sino Biological | 40592-T62 |
| 小鼠抗S2单克隆抗体 | Sino Biological | 40590-MM05 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 免疫方案 | 免疫剂量：S-2P为10 μg/只；LNT为200 μg/只；铝佐剂为100 μg/只。免疫途径：鼻内或肌肉。免疫方案：第0、21天两次（部分实验第112天加强）。 阅读提示：Methods中‘Vaccination and virus challenge’小节 |
| 病毒攻击 | 病毒株及剂量：祖先株10 PFU，Omicron BA.5为1000 PFU，EG.5为10 PFU；攻击途径：鼻内；攻击时间：加强后21天。 阅读提示：Methods中‘Vaccination and virus challenge’小节 |
| T细胞耗竭 | 抗体克隆和剂量：抗CD8α（53-6.7，200 μg）和抗CD4（YTS 191，200 μg）静脉注射；时间：挑战前第38、40天，挑战后第45天。 阅读提示：Methods中‘T cell depletion and IFN-γ neutralization’小节 |
| IFN-γ中和 | 抗IFN-γ抗体（XMG1.2，250 μg）静脉注射；时间：挑战前4小时，挑战后第3天。 阅读提示：Methods中‘T cell depletion and IFN-γ neutralization’小节 |
| 转录组分析 | RNA文库构建试剂盒：VVAHTS® Universal V8 RNA-seq Library Prep Kit；测序平台：Illumina NovaSeq 6000；分析阈值：P<0.05，|fold change|≥2。 阅读提示：Methods中‘RNA sequencing’小节 |