组织采集与单细胞悬液制备
获得高活力的扁桃体细胞用于类器官培养
新鲜扁桃体组织在组织保存液中运输，经碘伏消毒、抗菌培养基处理，机械剪碎后用胶原酶和DNA酶消化，经70 μm细胞筛过滤获得单细胞悬液，并用红细胞裂解液去除红细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用低浓度Matrigel培养生成具有上皮和生发中心层的扁桃体免疫类器官的方案
Protocol for generating human tonsil immune organoids with epithelial and germinal center layers using low-Matrigel culture.
实验完整度
中提供了详细的类器官培养、免疫荧光和流式细胞术步骤，但缺乏体内模型或患者样本验证，实验完整度中等。
主要模型
人扁桃体组织来源的免疫类器官 L-WRN细胞系
重点核对
使用5%低浓度Matrigel进行3D培养 细胞接种密度为每100 μL 2 × 10^6个活细胞 在Day 0添加4 μg/mL NTD抗原进行刺激 培养周期为15-20天 使用0.4 μm孔径的PET膜transwell插入物
摘要
扁桃体免疫类器官传统上仅包含上皮层或免疫区室，无法重现人类扁桃体的综合生理微环境。在此，我们提出一种利用低浓度Matrigel transwell系统生成同时重现上皮和生发中心样结构的扁桃体免疫类器官的方案。我们描述了类器官组装、免疫刺激以及上皮结构和生发中心形成的评估。该平台为剖析人类免疫反应、评估疫苗、发现抗体和探索自身免疫机制提供了多功能工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何生成同时包含上皮和生发中心样结构的扁桃体免疫类器官，以更好地模拟人类扁桃体的免疫微环境？
- 核心机制
- 低浓度Matrigel促进营养交换和免疫细胞迁移，同时支持上皮粘附；L-WRN条件培养基和细胞因子（如IL-21和BAFF）维持细胞活性和生发中心形成。
- 主要证据
- 免疫荧光显示CD20+ B细胞、CXCR4+暗区和CD83+亮区结构；流式细胞术显示B细胞亚群变化，如生发中心B细胞和浆母细胞增加。
- 研究意义
- 为研究上皮-免疫相互作用、生发中心生物学和黏膜免疫反应提供平台，可用于评估疫苗和佐剂以及发现中和抗体。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
L-WRN条件培养基制备
提供Wnt3a、R-spondin 3和Noggin以支持类器官生长
L-WRN细胞在含有G418和潮霉素B的选择培养基中复苏和扩增，待细胞达到高融合度后，收集连续4天的条件培养基，离心去除细胞碎片后储存于-80°C。
细胞播种与类器官培养
在transwell系统中建立3D培养以形成扁桃体类器官
将扁桃体细胞重悬于含有5% Matrigel和类器官培养基的溶液中，加入transwell上室，在37°C、5% CO2培养。每2天更换下室培养基，培养15-20天。
免疫荧光染色
可视化类器官中的上皮结构、生发中心区域和免疫细胞分布
收集类器官，用4% PFA固定，蔗糖梯度脱水，OCT包埋，冷冻切片（10 μm）。切片经封闭、一抗、二抗和三抗孵育，最后用含DAPI的封片剂封片，在共聚焦显微镜下成像。
流式细胞术分析
量化类器官中免疫细胞亚群和活化状态
用胰蛋白酶消化类器官，通过100 μm细胞筛获得单细胞悬液。用表面标记抗体染色，然后进行PI活性染色，通过流式细胞仪获取数据并用FlowJo分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织运输 | 组织保存液 | Miltenyi | 130-100-008 |
| 组织预处理 | 碘伏 | LIRCON | XY0058 |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco™ | 11320033 |
| 高糖DMEM培养基 | Cytiva | SH30022.01 | |
| 胎牛血清 | Gibco™ | 10270-106 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco™ | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco™ | 20-012-027 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25%) | Gibco™ | 25200072 | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco™ | 11140050 | |
| GlutaMAX™ | Gibco™ | 35050061 | |
| HEPES (1 M) | Gibco™ | 15630-080 | |
| Y-27632 (ROCK抑制剂) | MedChemExpress | HY-10071 | |
| Normocin™ | InvivoGen | ant-nr-05 | |
| 烟酰胺 | InvivoGen | HY-B0150 | |
| L-抗坏血酸 (维生素C) | Solarbio | 50-81-7 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| 人重组IL-21 | PeproTech | 200-21-10UG | |
| 重组人BAFF | GenScript | Z02976-1 | |
| 人HGF | GenScript | Z03229-10 | |
| 人重组bFGF | STEMCELL | 78003 | |
| 组织消化 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C1-28-100MG |
| II型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C2-28-100MG | |
| DNase I | Beyotime | D7076 | |
| 细胞处理 | 红细胞裂解液 | Solarbio | R1011 |
| 细胞冻存 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | C6295 |
| 细胞培养 | Matrigel基质胶 (低生长因子) | Corning | 356234 |
| 细胞计数 | 台盼蓝 (0.4%) | Sigma-Aldrich | 72-57-1 |
| L-WRN细胞选择 | G418 | ThermoFisher | 10131035 |
| 潮霉素B | ThermoFisher | 10687010 | |
| 免疫荧光封片 | SuperKine™增强型抗淬灭封片剂含DAPI | Abbkine | BMU107 |
| 免疫荧光封闭 | 山羊血清 | Abbkine | BMS0050 |
| 免疫荧光 | 蔗糖 | Solarbio | 57-50-1 |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 85112 | |
| 活性检测 | AM/PI活/死细胞活性检测试剂盒 | Beyotime | C2015M |
| 细胞系 | L-WRN细胞 | ATCC | CRL-2647 |
| 细胞筛 | 70 μm细胞筛 | Falcon | 352350 |
| 细胞培养 | 巴斯德吸管 | JETBIOFIL | PP102030 |
| 60 cm2 TC处理培养皿 | Corning | 430166 | |
| 100 cm2 TC处理培养皿 | Corning | 430167 | |
| 细胞冻存 | BeyoCool™细胞冻存盒 | Beyotime | FCFC012 |
| 细胞培养 | 金属冰盒 | Biosharp | BC032 |
| 细胞冻存 | 冻存管 (2 mL) | NEST | 607401 |
| 细胞培养 | 50 mL离心管 | Corning | 430790 |
| 15 mL离心管 | Corning | 430828 | |
| 组织研磨 | 5 mL注射器推杆 | Gufastore | GF22101402 |
| 细胞培养 | 0.4 μm transwell PET膜 | Corning | 3470 |
| 免疫荧光包埋 | Neg-50冷冻切片包埋剂 (OCT) | ThermoFisher | 6502B |
| 组织运输 | 母乳储存袋 | Hotsale | -- |
| 细胞培养 | CO2培养箱 (37°C, 5% CO2) | ESCO | CCL-050B-8 |
| 细胞复苏 | 水浴锅 | Thermo Scientific | TSGP02 |
| 免疫荧光成像 | 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus Corporation | FV3000 |
| 流式细胞术 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman | V0-B5-R3 |
| 抗原刺激 | SARS-CoV-2刺突蛋白N端结构域 (NTD) | Sino Biological | 40591-V49H |
| 免疫荧光 | 纯化抗人CXCR4 (CD184)抗体 | BioLegend | 306501 |
| 人CD83重组兔抗体 | Abcam | ab205343 | |
| 泛角蛋白多克隆抗体 | proteintech | 26411-1-AP | |
| 流式细胞术 | PE抗人CD45抗体 | BioLegend | 304008 |
| BV421小鼠抗人CD45 | BD Biosciences | 563879 | |
| BV510小鼠抗人CD45 | BD Biosciences | 563204 | |
| 免疫荧光 | 抗人CD20单克隆抗体 (L26), eFluor™ 660 | eBioscience™ | 50-0202-82 |
| F(ab')2-山羊抗兔IgG (H+L) Alexa Fluor™ plus 488 | Invitrogen | A48282TR | |
| F(ab')2-山羊抗小鼠IgG (H+L) Alexa Fluor™ plus 555 | Invitrogen | A48287 | |
| 流式细胞术 | FITC抗人CD3 | BioLegend | 300440 |
| Alexa Fluor® 700抗人CD19抗体 | BD Biosciences | 363034 | |
| BD Horizon™ BV510小鼠抗人CD27 | BD Biosciences | 563090 | |
| APC抗人CD38抗体 | BioLegend | 303510 | |
| BV421小鼠抗人CD86 | BD Biosciences | 562432 | |
| APC抗人CD4 | BioLegend | 317318 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织采集与处理 | 组织来源、运输时间、处理时间、细胞活力 阅读提示：Preparation one: Human tonsil sample handling and single-cell suspension collection |
| L-WRN条件培养基制备 | 细胞培养条件、选择药物浓度、融合度、收集时间 阅读提示：Preparation two: L-WRN conditioned medium collection |
| 类器官培养 | Matrigel浓度、细胞密度、抗原刺激浓度、培养周期 阅读提示：Step-by-step method details: Generation of human tonsil immune organoids |
| 免疫荧光染色 | 固定剂、蔗糖浓度、切片厚度、抗体浓度、孵育时间 阅读提示：Step-by-step method details: Immunofluorescence staining of tonsil immune organoids |
| 流式细胞术 | 消化条件、抗体组合、PI染色、获取时间 阅读提示：Step-by-step method details: Flow cytometric analysis of tonsil organoids |