建立筛选系统
构建一个能够系统评估ISG对多种病毒影响的高通量筛选平台。
在A549细胞中稳定表达H2B-mRFP或H2B-eGFP，并感染表达互补荧光蛋白的报告病毒。通过活细胞成像监测病毒复制动力学。
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ISG图谱：功能缺失分析表征干扰素刺激基因的抗病毒特性
The ISG Atlas: a loss-of-function analysis characterizes antiviral properties of interferon stimulated genes.
实验完整度
高包含阵列式功能缺失筛选、病毒复制动力学分析、蛋白质组学与相互作用组学分析，以及BORCS8的机制验证和SARS-CoV-2感染实验。
主要模型
A549细胞系 A549-ACE2细胞系 Calu-3细胞系 SK-N-SH细胞系 人原代包皮成纤维细胞（HFF）
重点核对
A549细胞中稳定表达H2B-mRFP或H2B-eGFP，用于活细胞成像 以285个ISG的CRISPR/Cas9敲除细胞系为模型，每种基因使用三个sgRNA 病毒特异性的IFNα预处理剂量（如HSV-1 50 U/mL，SARS-CoV-2 6.25 U/mL） 多种报告病毒（HSV-1、MeV、RVFV、SARS-CoV-2、SFV、VACV、VSV、YFV）感染和活细胞成像时间序列 SARS-CoV-2感染实验在BSL3实验室进行，使用MOI 3
摘要
先天免疫系统需要干扰素刺激基因（ISG）的活性来对病毒产生保护性反应。然而，ISG对病毒的活性差异很大，并受数百种ISG相互作用的调控。利用时间分辨的阵列式功能缺失筛选，我们系统研究了285个ISG对八种病毒的病毒调节活性。筛选结果的定量数据不一定产生基因功能的相似定量生物学效应，但表明许多ISG具有病毒特异性，且某些ISG（如RNA 2’,3’-环磷酸和5’-OH连接酶（RTCB））具有泛促病毒活性。选定候选基因的共缺失鉴定出具有协同功能的ISG，强调了抑制进入途径的ISG与参与IFN信号传导的ISG之间特别强的协同作用。在未探索的ISG中，我们鉴定出BORCS8，它在调节SARS-CoV-2感染中发挥特别突出的作用。机制上，BORCS8在病毒进入期间介导早期内体的酸化，这一过程已知促进病毒颗粒的降解。总之，这一广泛资源揭示了此筛选系统中ISG的特异性，并提出了抗病毒治疗方案的潜在策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 旨在系统鉴定干扰素刺激基因（ISG）对多种病毒的调节活性，并探索其机制和潜在治疗策略。
- 核心机制
- BORCS8通过维持早期内体的酸化过程限制SARS-CoV-2进入，其缺失导致内体酸化缺陷和增强的内吞摄取。
- 主要证据
- 通过阵列式CRISPR/Cas9敲除筛选并通过活细胞成像量化病毒复制动力学，鉴定出285个ISG对八种病毒的作用；进一步通过伪病毒实验和晚期内体酸化分析验证了BORCS8在病毒进入中的功能。
- 研究意义
- 该资源提供了ISG抗病毒功能的全面图谱，为理解先天免疫的组织方式提供了基础，并为优化抗病毒治疗策略提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ISG敲除筛选
确定每个ISG对病毒复制的影响，并识别其抗病毒或促病毒作用。
利用CRISPR/Cas9技术敲除300个ISG（最终分析285个），并用IFNα预处理后感染八种病毒，分析病毒复制曲线参数（K值、τ值、β值）。
数据聚类和功能关联分析
识别具有相似功能的ISG群，并发现新的功能关联。
使用自组织映射（SOM）对筛选数据（K值、τ值、β值）进行聚类，并分析聚类结果与已知功能的关系。
RTCB的机制验证
验证RTCB的促病毒活性及其分子机制。
通过蛋白质组学分析RTCB敲除细胞的蛋白表达变化，以及RTCB过表达细胞的相互作用组，分析其功能关联。
SARS-CoV-2相关ISG的深入分析
研究与SARS-CoV-2感染表型相关的ISG，并揭示它们调控病毒复制的机制。
对19个对SARS-CoV-2有表型的ISG进行蛋白质组学和相互作用组学分析，并通过GO和CORUM富集分析确定其功能途径。
协同效应分析
检测ISG共缺失对SARS-CoV-2复制的协同影响。
对19个ISG进行两两组合的共缺失，并通过活细胞成像评估SARS-CoV-2-GFP复制，计算相互作用分数。
BORCS8的机制研究
阐明BORCS8限制SARS-CoV-2感染的具体机制。
通过内体酸化检测、伪病毒感染、免疫荧光和蛋白质组学分析BORCS8的功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 病毒包装 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 24765 |
| 基因敲除 | LentiCRISPRv2 | Addgene | #52961 |
| 筛选 | IFNα b/d | -- | -- |
| 抑制剂处理 | 甲磺酸卡莫司他 | Santa Cruz | sc-203867 |
| 蛋白表达诱导 | 强力霉素 | Sigma-Aldrich | D5207 |
| RT-qPCR | NucleoSpin RNA Plus试剂盒 | Macherey-Nagel | 740984 |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR047B | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | A25741 | |
| 活细胞成像 | IncuCyte S3 | Sartorius | -- |
| 质谱分析 | Q Exactive液相色谱-质谱联用 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ReproSil-Pur C18-AQ | Dr. Maisch | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | 23225 | |
| Lys-C | Wako Chemicals | 4548995075888 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 蛋白纯化 | α-V5-琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A2095 |
| 免疫荧光 | LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
| pHrodo Green葡聚糖 | Invitrogen | P35368 | |
| 葡聚糖Alexa Fluor 647 | Invitrogen | D22914 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 筛选系统建立 | A549细胞稳定表达H2B-mRFP或H2B-eGFP，以及八种报告病毒株和IFNα预处理剂量 阅读提示：Methods: Cell lines and culture conditions, Virus stock preparations, IFNα and inhibitor pre-treatment |
| 基因敲除 | CRISPR/Cas9敲除的sgRNA序列和转导MOI，敲除效率验证，细胞生长监测 阅读提示：Methods: Guide sequence design and cloning, Generation and handling of knockout cell lines |
| 病毒动力学分析 | 感染MOI，活细胞成像时间间隔，曲线拟合参数（K值、τ值、β值） 阅读提示：Methods: Image acquisition and modeling of viral infection kinetics |
| 协同分析 | 双敲除顺序，药物选择，相互作用分数计算方法和阈值 阅读提示：Methods: Double KO screening and data processing |
| BORCS8机制验证 | 内体酸化检测染料（LysoTracker, pHrodo），TMPRSS2表达和camostat处理剂量 阅读提示：Methods: Immunofluorescence analysis, IFNα and inhibitor pre-treatment |