噬菌体展示筛选Bicycle分子
识别针对SARS-CoV-2 N蛋白不同结构域的高亲和力Bicycle分子。
使用生物素化的全长、CTD和NTD重组蛋白进行溶液相淘选，经过四轮筛选后，通过AlphaScreen和BLI鉴定亲和力。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用约束双环肽进行体外诊断
Utilizing Constrained Bicyclic Peptides for In Vitro Diagnostics.
实验完整度
高包含体外结合实验（BLI）、晶体结构、ELISA/NLISA/LFIA功能验证、交叉反应性测试等多个证据层级。
主要模型
SARS-CoV-2核衣壳蛋白重组抗原 Bicycle噬菌体展示文库 ELISA/NLISA/ LFIA平台
重点核对
Bicycle分子与抗体的配对组合（如B003-40588-MM124） SARS-CoV-2 N蛋白浓度梯度 交叉反应性测试（其他HCoV N蛋白） 检测限计算方法（Holstein等）
摘要
对生物靶标具有高亲和力的约束双环肽（Bicycle分子）已成为潜在强大的治疗剂，特别是在体内靶向癌症受体方面。然而，其抗体模拟特性尚未被探索用于诊断免疫测定中。这些合成衍生物作为生物识别支架，允许简便的位点选择性修饰和大规模生产。针对SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白的各种构建体进行的噬菌体展示筛选，识别出几个结合亲和力从微摩尔到低纳摩尔范围的Bicycle分子。这些Bicycle分子在酶联免疫吸附测定和纳米酶联免疫吸附测定以及用于检测超低浓度SARS-CoV-2 N蛋白的酶促和比色纳米颗粒侧向层析免疫测定（LFIA）的开发中得到了验证。我们设想这些部分能够通过利用其高结合亲和力、最小化支架和合成可及性，实现稳健、经济高效且大规模的超灵敏生物传感器开发，适用于多种生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 约束双环肽能否作为抗体模拟物用于体外诊断免疫测定，实现对SARS-CoV-2 N蛋白的高灵敏检测？
- 核心机制
- 约束双环肽通过噬菌体展示筛选获得高亲和力结合靶标，其最小化支架减少非特异性结合，且可位点特异性修饰使其易于整合到免疫分析平台。
- 主要证据
- 通过ELISA、NLISA和LFIA实验，Bicycle-IgG配对组合实现了对N蛋白的检测，其中ELISA的LoD为250 pg/mL，NLISA为97 pg/mL，LFIA的vLoD低至40 pg/mL，且与其他HCoV无交叉反应。
- 研究意义
- 约束双环肽作为抗体替代品，可低成本、规模化生产，为开发多种生物标志物的超灵敏生物传感器提供新途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ELISA优化与验证
测试Bicycle分子作为捕获抗体在ELISA中检测N蛋白的性能。
将生物素化Bicycle分子包被在链霉亲和素板上，加入不同浓度N蛋白，然后加入检测IgG和HRP标记的二抗，通过TMB显色测量OD450。
NLISA优化与验证
使用纳米酶（PtNC）作为标记物，评估NLISA的灵敏度。
类似ELISA步骤，但检测抗体通过物理吸附偶联到PtNC上，用于信号放大。
LFIA开发
验证Bicycle分子在纸基侧向层析平台上的检测能力。
将生物素化Bicycle分子固定在测试线，样本与PtNC或AuNP标记的检测抗体孵育，通过层析作用显色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
筛选与鉴定Bicycle分子
结构解析
纳米颗粒合成与表征
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达纯化 | pExp-MBP质粒 | Addgene | 112568 |
| Ni-NTA柱 | Cube Biotech | -- | |
| 直链淀粉柱 | New England Biolabs | -- | |
| HiTrap SP HP柱 | Cytiva | -- | |
| Superdex 75 16/600柱 | Cytiva | -- | |
| 噬菌体展示 | 链霉亲和素磁珠 | -- | -- |
| 结合亲和力测定 | Octet RED96e | Sartorius | -- |
| 晶体学 | Mosquito机器人系统 | SPT Labtech | -- |
| Phaser | CCP4 | -- | |
| Refmac | CCP4 | -- | |
| Coot | -- | -- | |
| AceDRG | CCP4 | -- | |
| 纳米颗粒合成 | 三水合氯化金(III) | Sigma | -- |
| 二水合柠檬酸三钠 | Sigma | -- | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | -- | |
| DLS | Zetasizer Nano ZS | Malvern | -- |
| TEM | JEOL 2100F | JEOL | -- |
| Gatan Orius SC1000相机 | Gatan | -- | |
| UV-Vis | Nanodrop 2000c | Thermo Scientific | -- |
| ELISA/NLISA | Pierce链霉亲和素包被高容量板 | Thermo Scientific | -- |
| TMB溶液 | -- | -- | |
| 抗小鼠HRP | Abcam | ab97046 | |
| SpectraMax M5酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| SoftMax Pro 7.1.2 | Molecular Devices | -- | |
| LFIA | Mologic Ltd.聚链霉亲和素印刷试纸条 | Mologic Ltd. | -- |
| Pierce CN/DAB底物试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 30%过氧化氢溶液 | Sigma | -- | |
| Canon PowerShot G15 | Canon | -- | |
| iPhone 13 | Apple | -- | |
| ImageJ | -- | -- | |
| 一般 | Protein LoBind样品管 | Eppendorf | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 噬菌体展示筛选 | 目标蛋白构建体（全长、CTD、NTD），生物素化，筛选轮数，靶蛋白浓度递减，洗脱条件 阅读提示：Methods: Identification of Bicycle Binders against SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein Using Phage Display |
| ELISA | Bicycle分子浓度（1 μM），检测IgG浓度（0.25 ng/mL），N蛋白浓度梯度，孵育时间，洗涤步骤，TMB底物组成 阅读提示：Methods: Heatmap ELISA, Serial Dilution ELISA |
| NLISA | Bicycle分子浓度（1 μM），PtNC-IgG浓度（2 pM），N蛋白浓度梯度，TMB底物（含H2O2浓度） 阅读提示：Methods: Heatmap NLISA, Serial Dilution NLISA |
| LFIA (PtNC) | Bicycle分子浓度（1 μM），PtNC-IgG浓度（100 pM），样本体积（50 μL），运行缓冲液组成，显色底物和过氧化氢浓度 阅读提示：Methods: PtNC Lateral Flow Immunoassays |
| LFIA (AuNP) | Bicycle分子浓度（1 μM），AuNP-IgG浓度（OD530=1.0），样本体积（50 μL），样本基质（缓冲液或唾液） 阅读提示：Methods: AuNP Lateral Flow Immunoassays |