重组gH/gL蛋白表达与验证
制备用于免疫分析、B细胞分选和结构研究的可溶性gH/gL复合物。
在293细胞中共转染gH和gL质粒,通过亲和纯化和SEC纯化蛋白,并通过SDS-PAGE、质谱和BLI验证其糖基化及结合EphA2的能力。
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卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染诱发的单克隆中和抗体揭示gH/gL上的关键脆弱位点
Monoclonal neutralizing antibodies elicited by infection with Kaposi sarcoma-associated herpesvirus reveal critical sites of vulnerability on gH/gL.
实验完整度
高包含重组蛋白表达纯化、抗体分离与功能验证(中和、融合抑制)、表位竞争分析,以及nsEM和cryo-EM结构解析等多层级实验。
主要模型
293细胞(重组gH/gL表达) Vero细胞(KSHV感染中和实验) RPMI8226 B细胞系(KSHV感染中和实验) CHO-K1/293T细胞(无病毒融合实验)
重点核对
KSHV gH/gL重组蛋白在293细胞中共表达,并通过Ni-NTA和SEC纯化(Fig 1B, Methods) 记忆B细胞分选策略(CD3-CD14-CD19+IgD-IgG+及gH/gL双阳性, Fig 3B, Methods) 中和实验使用Vero细胞和RPMI8226细胞(Fig 5, Methods) 表位分箱竞争BLI和nsEM/cryo-EM结构解析(Fig 4, 6, 7, 8)
摘要
卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是一种致癌病毒,可导致卡波西肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤和多中心Castleman病。预防KSHV感染或用于治疗KSHV相关疾病的疫苗是亟待满足的关键需求,然而,疫苗应引发的免疫反应类型尚未明确。gH/gL糖蛋白复合物是KSHV中和抗体的重要靶点,但这些抗体靶向的表位特异性仍未知。在此,我们从KSHV感染者中分离出12种gH/gL特异性单克隆抗体(mAbs),并进行了结构/功能分析。这些mAbs以纳摩尔亲和力结合重组gH/gL,表位分箱分析显示这些mAbs结合gH/gL上的5个表位簇。7种mAbs能够中和KSHV对上皮细胞系的感染。两种强效中和mAbs定位于EphA2结合位点,这是通过抑制受体-配体相互作用以及mAb/gH/gL复合物的负染电子显微镜(nsEM)确定的。其他靶向新脆弱位点的中和mAbs的表位通过冷冻电子显微镜和nsEM的组合确定。总之,这些mAbs有助于定义KSHV疫苗设计的相关表位靶点,有助于理解抗体在预防KSHV感染中的作用,支持免疫治疗方法的开发,并提供有价值的工具来理解KSHV进入过程的分子细节。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 确定KSHV感染者体内针对gH/gL蛋白的中和抗体靶向哪些表位,并评估这些表位作为疫苗靶点的潜力。
- 核心机制
- gH/gL上的EphA2结合位点是一个关键的脆弱位点,中和抗体MLKH1和MLKH5通过直接阻断gH/gL-EphA2相互作用来中和病毒;此外,gH/gL的D-II、D-III和D-IV结构域上存在多个新的中和表位。
- 主要证据
- 从感染者PBMC中分选并表达12种gH/gL特异性单克隆抗体;竞争BLI鉴定出5个表位簇;Vero细胞中和实验显示7种抗体有效中和,其中MLKH1和MLKH5靶向EphA2结合位点;nsEM和cryo-EM解析了多个中和抗体的结合位置。
- 研究意义
- 这些发现定义了KSHV gH/gL上对疫苗设计至关重要的脆弱位点,并为理解KSHV进入机制和开发免疫治疗策略提供了工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
队列血清/血浆反应性分析
评估KSHV感染者体内是否存在针对gH/gL的抗体,以及中和活性与结合滴度的关系。
对乌干达队列的23份血浆样本进行ELISA检测gH/gL结合滴度,并对Vero细胞进行KSHV中和实验,同时用PCR检测KSHV DNA。
gH/gL特异性记忆B细胞分选与单抗克隆
从KSHV感染者中分离出靶向gH/gL的单克隆抗体。
利用生物素化gH/gL和链霉亲和素-PE/APC四聚体标记记忆B细胞,通过流式分选单细胞,RT-PCR克隆抗体基因,并表达为重组抗体。
单克隆抗体的功能表征
评估分离的单克隆抗体中和KSHV感染和抑制膜融合的能力。
在Vero细胞和RPMI8226细胞上进行中和实验,计算IC50;在CHO-K1/293T细胞上进行无病毒融合抑制实验。
表位竞争分析与结构解析
确定单克隆抗体的表位位置及其与EphA2结合位点的关系。
通过竞争BLI将抗体分为5个表位簇;通过BLI检测抗体对gH/gL-EphA2相互作用的抑制;通过nsEM和cryo-EM解析抗体/蛋白复合物的结构。
基因谱系与序列分析
分析单克隆抗体的基因使用和体细胞突变情况,以了解其成熟过程。
通过Sanger测序获得抗体可变区序列,分析VH/VL基因使用,并与种系序列比对计算突变率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
生物物理表征
血清学检测
B细胞分选与单抗克隆
病毒中和实验
细胞融合检测
蛋白鉴定
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Freestyle 293表达培养基 | Thermo Fisher | 12338026 |
| 胎牛血清 | Cytiva | SH30071.03 | |
| RPMI培养基 | Gibco | 11875-093 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 | |
| 重组蛋白表达 | PEI Max转染试剂 | Polysciences | 24765 |
| 重组蛋白纯化 | Ni-NTA树脂 | GoldBio | H-350-100 |
| Superdex 200pg柱 | Cytiva Lifesciences | -- | |
| Pierce IgG洗脱缓冲液 | Pierce | 21004 | |
| LysC内切蛋白酶 | NEB | P8109S | |
| 质谱分析 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| Easy-nLC 1000纳升液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Proteome Discoverer 2.5软件 | Thermo Scientific | -- | |
| ELISA | Immulon 2HB ELISA板 | ThermoFisher Scientific | 3455 |
| 山羊抗人免疫球蛋白HRP | Southern Biotech | 2010-05 | |
| SureBlue Reserve TMB微孔过氧化物酶底物 | SeraCare | 5120-0081 | |
| SpectraMax M2酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 抗原标记 | EZ-Link NHS-PEG4生物素 | Thermo Fisher | A39259 |
| 链霉亲和素-藻红蛋白 | Agilent | PJRS301-1 | |
| 链霉亲和素-别藻蓝蛋白 | Agilent | PJ27S-1 | |
| B细胞分选 | EasySep人B细胞富集试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19054 |
| CD3-FITC抗体 | BD Biosciences | 556611 | |
| CD14-FITC抗体 | BD Biosciences | 557153 | |
| IgD-PerCP-Cy5.5抗体 | eBioscience | 46-9868-42 | |
| IgG-BV421抗体 | BD Biosciences | 562581 | |
| CD19-BV711抗体 | BioLegend | 302246 | |
| 可固定活力染料eFluor 506 | eBioscience | 65-0866-14 | |
| FACSymphony S6流式细胞仪 | BD | -- | |
| 单抗克隆 | Superscript IV逆转录酶 | Invitrogen | 18090200 |
| HotStarTaq Plus DNA聚合酶 | Qiagen | 203605 | |
| QIAprep质粒小提试剂盒 | Qiagen | 27106 | |
| In-Fusion HD连接酶 | Takara Bio | 639650 | |
| Monarch PCR和DNA纯化试剂盒 | NEB | T1030L | |
| BLI | Octet Red生物层干涉仪 | Sartorius | -- |
| 抗人IgG Fc捕获(AHC)传感器 | Sartorius | 18-5060 | |
| 生物素化EphA2蛋白 | Sino Biological | 13926-H27H-B | |
| 中和实验 | 聚凝胺 | Sigma Aldrich | TR-1003 |
| Typhoon Trio成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| ImageJ图像分析软件 | -- | -- | |
| 融合实验 | GeneJuice转染试剂 | Fisher Scientific | 70967-6 |
| SteadyGlo荧光素酶试剂 | Thermo Fisher Scientific | E2520 | |
| Glomax发光检测仪 | Promega | -- | |
| nsEM | 碳稳定Formvar膜400目铜网 | Ted Pella Inc | 01754-F |
| PELCO easiGlow辉光放电清洗系统 | Ted Pella INC | 91000 | |
| 甲酸铀酰 | -- | -- | |
| Leginon自动数据采集软件 | -- | -- | |
| Talos L120C G2透射电镜 | Thermo Fischer Scientific | -- | |
| Ceta CMOS相机 | Thermo Scientific | -- | |
| CryoSPARC v4软件 | -- | -- | |
| cryo-EM | Quantifoil R1.2/R1.3 + 2mm Cu300网格 | Ted Pella | -- |
| UltrAuFoil R1.2/1.3 Au300网格 | Ted Pella | -- | |
| Tergeo-Plus等离子清洗机 | PIE scientific | PIE-TP100 | |
| Vitrobot Mark IV冷冻制备仪 | ThermoFisher | -- | |
| Glacios电镜 | ThermoFisher | -- | |
| K3直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| SerialEM软件 | -- | -- | |
| Warp软件 | -- | -- | |
| Phenix软件 | -- | -- | |
| Coot软件 | -- | -- | |
| ISOLDE软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组gH/gL表达与纯化 | 使用的293细胞系(293-6E)、培养基(Freestyle 293)、转染试剂(PEI Max)及表达时间(6天);纯化用的Ni-NTA树脂和SEC柱(Superdex 200pg)品牌及型号;gH和gL质粒构建信息 阅读提示：Methods: Cell lines, Plasmids, Recombinant protein expression; Fig 1 |
| 血浆gH/gL抗体检测 | ELISA包被抗原浓度(200ng/孔)、血清稀释方式(3倍系列稀释)及阈值定义;血浆热灭活条件(56°C 60分钟);KSHV DNA PCR检测的ORF73基因及阳性阈值(>150拷贝/mL) 阅读提示：Methods: ELISA, qPCR assay for KSHV DNA; Fig 2 |
| B细胞分选与单抗克隆 | PBMC供体选择标准(KSHV PCR+且gH/gL结合滴度高,如U035-22-MO);标记抗原浓度(1µM);单细胞分选的标志物组合(Live/dead-, CD3-, CD14-, CD19+, IgD-, IgG+, PE-DL650-, PE+, APC+);RT-PCR和克隆方法 阅读提示：Methods: B cell sorting, Amplification and cloning of VH and VL transcripts; Fig 3 |
| 单克隆抗体的中和及融合抑制实验 | 中和实验使用的细胞系(Vero, RPMI8226)、病毒株(rKSHV.219, 100 pfu/孔)、抗体浓度(100 µg/mL筛选, 系列稀释测IC50)、感染时间(5天或3天)和检测方法(荧光斑或GFP);融合实验使用的质粒(gH, gL, EBV gB, T7-Luc)、抗体浓度(2 µg/well)和检测方法(荧光素酶活性) 阅读提示：Methods: Neutralization assays, Virus-free fusion assay; Fig 5 |
| 表位竞争与结构解析 | BLI竞争实验的gH/gL浓度(290nM)和抗体浓度(10 µg/mL);EphA2结合抑制试验的蛋白浓度(100 nM gH/gL, 200 nM mAb);nsEM和cryo-EM样品的复合物比例、浓度、染色或冷冻条件 阅读提示：Methods: Biolayer interferometry (BLI), Negative stain electron microscopy, Cryo-electron microscopy; Fig 4, 6, 7, 8 |