噬菌体展示筛选抗LAG-3 sdAb
从噬菌体展示库中筛选特异性结合人LAG-3的单域抗体。
以重组人LAG-3-mFc蛋白为抗原，进行3轮噬菌体淘选，富集特异性克隆，并通过ELISA筛选阳性克隆，测序获得sdAb序列。
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一种靶向LAG-3的强效单域抗体用于高效肿瘤免疫治疗
A Potent Single-Domain Antibody Targeting LAG-3 for Efficient Tumor Immunotherapy.
实验完整度
高包含体外分子结合、细胞功能、表位定位、体内异种移植模型及药代动力学等多个独立实验层级，并进行功能验证。
主要模型
人源化异种移植NSCLC小鼠模型（huPBMC-NOG-dKO小鼠接种A549细胞） SEB刺激的人原代PBMC HEK-LAG3-EGFP细胞 Raji细胞
重点核对
噬菌体淘选轮数：3轮，洗涤严格度递增 竞争性ELISA中sdAb浓度：1000 nM，LAG3-mFc浓度：100 nM 竞争性流式细胞术：sdAb从1 μM起始3倍稀释，LAG3-mFc浓度200 nM T细胞激活实验：SEB刺激PBMC培养5天，sdAb浓度1 μM 体内实验：A549细胞接种5×10^6，PBMC尾静脉注射5×10^6，治疗剂量10 mg/kg，每4天一次，共8周
摘要
淋巴细胞活化基因-3（LAG-3）是关键的免疫检查点受体，对T细胞功能发挥负调控作用。尽管LAG-3阻断抗体已显示出有前景的临床潜力，但传统单克隆抗体的固有局限性促使开发具有增强生物学和药理学特性的新型抗体格式。本研究通过噬菌体展示技术生成了一系列靶向人LAG-3的单域抗体（sdAbs）。在这些候选抗体中，2H-G7被鉴定为高亲和力sdAb，其与LAG-3结合的平衡解离常数（KD）在纳摩尔范围内。值得注意的是，2H-G7能有效阻断LAG-3与其两个关键配体纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）和主要组织相容性复合体II类（MHC-II）的相互作用。通过量化刺激的原代人外周血单个核细胞（PBMCs）中白介素-2（IL-2）分泌和CD69表达，验证了其恢复受损T细胞功能的能力。表位作图研究将2H-G7的结合位点定位到LAG-3的D1D2胞外结构域，不同于作为基准的临床批准的LAG-3阻断抗体relatlimab。在非小细胞肺癌（NSCLC）的异种小鼠模型中，与relatlimab相比，2H-G7-Fc表现出更优的肿瘤生长抑制功效。这些发现表明，2H-G7是开发下一代LAG-3靶向肿瘤免疫疗法的有前景的先导候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发具有增强生物学和药理学特性的靶向LAG-3的新型抗体格式，并评估其抗肿瘤疗效。
- 核心机制
- 2H-G7通过同时阻断LAG-3与FGL1和MHC-II的相互作用，解除LAG-3介导的T细胞抑制，恢复T细胞功能。
- 主要证据
- 体外实验中，2H-G7阻断LAG-3与FGL1和MHC-II结合，恢复SEB刺激PBMC的IL-2分泌和CD69表达；体内实验中，2H-G7-Fc在人源化NSCLC小鼠模型中显著抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 2H-G7作为下一代LAG-3靶向肿瘤免疫疗法的有前景先导候选药物，其双配体阻断机制和sdAb平台优势具有临床应用潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
sdAb结合特性分析
评估候选sdAb与LAG-3的结合亲和力和特异性。
通过间接ELISA检测sdAb与LAG-3的结合，通过流式细胞术检测与细胞表面LAG-3的结合，通过生物层干涉法（BLI）测定动力学参数和KD值。
体外阻断LAG-3-配体相互作用
验证sdAb能否阻断LAG-3与FGL1和MHC-II的结合。
通过竞争性ELISA评估sdAb阻断LAG-3-FGL1结合的能力，通过竞争性流式细胞术评估sdAb阻断LAG-3-MHC-II结合的能力。
T细胞功能恢复实验
评估sdAb能否恢复SEB刺激的人PBMC中T细胞的激活功能。
人PBMC与SEB和sdAb共培养5天，收集上清检测IL-2分泌，流式细胞术检测CD69表达。
表位定位
确定2H-G7在LAG-3上的结合表位。
构建LAG-3截短蛋白D1D2，通过ELISA检测2H-G7的结合；通过竞争性ELISA评估2H-G7与relatlimab结合是否相互干扰；分子对接模拟验证结合位点。
体内抗肿瘤疗效评估
评估2H-G7-Fc在人源化NSCLC小鼠模型中的抗肿瘤疗效。
huPBMC-NOG-dKO小鼠皮下接种A549细胞，尾静脉注射人PBMC重建免疫系统，当肿瘤体积达到100-150 mm3时随机分组，分别给予PBS、relatlimab或2H-G7-Fc治疗，监测肿瘤体积、体重和生存，终点测量肿瘤重量，流式分析肿瘤浸润T细胞。
药代动力学分析
比较2H-G7-Fc和relatlimab在小鼠体内的药代动力学特征。
Balb/C小鼠单次静脉注射10 mg/kg抗体，按时间点采血，ELISA测定血清抗体浓度，计算药代参数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875093 |
| 胎牛血清 | NCM biotech | C9500 | |
| OPM-293 CD05培养基 | OPM Biosciences | 81075-001 | |
| DMEM培养基 | 上海中乔新舟生物科技 | ZQ-100 | |
| F-12K培养基 | Gibco | 21127022 | |
| 噬菌体淘选 | TG1感受态细胞 | Lucigen | 605021 |
| 辅助噬菌体 | NEB | N0315S | |
| 抗M13单克隆抗体 | Sino Biological | 11973-MM05T-H | |
| ELISA | TMB底物 | NCM biotech | M30100 |
| 印迹级封闭剂 | Bio-Rad | 1706404 | |
| HRP偶联抗FLAG抗体 | GenScript | A01428 | |
| 流式细胞术 | Alexa-488偶联抗FLAG抗体 | GenScript | A01809 |
| 流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| BLI | Gator Plus系统 | Gator Bio | -- |
| 抗人Fc捕获生物传感器探针 | Gator Bio | 20-5036 | |
| 竞争性ELISA | HRP偶联亲和纯化山羊抗小鼠IgG（H+L） | Jackson Immuno Research | 115-035-003 |
| 竞争性流式细胞术 | Alexa-647偶联抗小鼠Fc抗体 | BioLegend | 405322 |
| T细胞激活实验 | 葡萄球菌肠毒素B | Toxin Technology | BT202 |
| IL-2 ELISA试剂盒 | Beyotime | PI580 | |
| FITC抗人CD69抗体 | BioLegend | 310904 | |
| 表位作图 | HRP偶联抗人IgG抗体 | AlpVHHs | 023-112-005 |
| 抗DYKDDDDK标签抗体 | AlpVHHs | 016-303-005 | |
| 抗体稳定性分析 | Prometheus Panta仪器 | NANOTEMPER | -- |
| 动物实验 | huPBMC-NOG-dKO小鼠 | 北京维通利华 | -- |
| relatlimab | Sino Biological | 68142-H001 | |
| 肿瘤浸润T细胞分析 | 抗CD45-APC抗体 | Sino Biological | 10086-MM05-A |
| 抗CD4-488抗体 | Thermo Fisher | 53-0049-42 | |
| 抗CD8-PE抗体 | Sino Biological | 10980-MM48-P |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Methods 2.1 Cell Lines |
| 噬菌体淘选 | 抗原包被浓度、洗涤次数、淘选轮数 阅读提示：Methods 2.2 Phage Panning |
| 抗体结合分析 | ELISA中抗体稀释范围、BLI中抗原固定时间、分析模型 阅读提示：Methods 2.3, 2.4, 2.5 |
| LAG-3配体阻断实验 | sdAb和配体浓度、孵育时间、检测方法 阅读提示：Methods 2.6, 2.7 |
| T细胞激活实验 | PBMC来源、SEB浓度、培养时间、检测指标 阅读提示：Methods 2.8 |
| 表位定位 | 使用蛋白截短体、抗体浓度、竞争模式 阅读提示：Methods 2.9, 2.10 |
| 体内抗肿瘤实验 | 小鼠品系、细胞接种量、PBMC注射量、治疗剂量和周期 阅读提示：Methods 2.13 |
| 药代动力学 | 给药剂量、采血时间点、检测方法 阅读提示：Methods 2.15 |