cDNA过表达筛选鉴定限制因子
筛选抑制SARS-CoV-2假病毒进入的宿主基因
使用包含10,001个人类基因的cDNA文库转染HEK293T-ACE2细胞，然后感染SARS-CoV-2假病毒，通过GFP报告基因检测进入效率，计算Z-score，鉴定显著抑制进入的基因。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
分泌型全长人前体蛋白PSAP通过促进刺突蛋白S1亚基的释放抑制SARS-CoV-2感染
Secretory full-length human prosaposin (PSAP) inhibits SARS-CoV-2 infection through facilitating the release of S1 subunit of spike protein.
实验完整度
高包含体外过表达筛选、siRNA敲低、CRISPR-Cas9敲除、假病毒和真实病毒感染实验、BLI亲和力测定、ELISA竞争实验、流式细胞术和分子对接等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 HEK293T-ACE2细胞 稳定表达刺突蛋白的293T细胞 SARS-CoV-2假病毒和真实病毒
重点核对
PSAP过表达剂量（0.2, 0.5, 0.7, 1 μg质粒） PSAP-His蛋白浓度（100, 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0 μg/mL） 病毒感染复数（MOI=0.05） siRNA敲低和CRISPR-Cas9敲除细胞系 PSAP与S1结合的平衡解离常数（KD=1.279×10^-9 M）
摘要
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的COVID-19大流行对全球公共卫生和经济产生了深远影响。系统筛选影响病毒感染宿主因子对于理解病毒-宿主相互作用和开发靶向宿主的抗病毒策略至关重要。在此，我们进行了宿主cDNA过表达筛选，以鉴定参与调控SARS-CoV-2复制的宿主因子。该方法鉴定出prosaposin（PSAP），一种溶酶体saposin激活剂（saposin A、B、C和D）的前体，作为阻断SARS-CoV-2进入的有效宿主限制因子。我们证明PSAP与SARS-CoV-2刺突（S）蛋白的受体结合域（RBD）高亲和力结合。分泌的PSAP有效抑制SARS-CoV-2假病毒和真实病毒的感染。机制上，PSAP结合促进S1亚基从S蛋白上释放。分子对接分析进一步揭示PSAP与RBD的非受体结合基序（non-RBM）区域相互作用。这些结果表明PSAP通过类似于中和抗体的机制抑制SARS-CoV-2进入。我们的发现强调了PSAP作为抗SARS-CoV-2感染的新型宿主限制因子，为对抗SARS-CoV-2的潜在治疗策略提供了新见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些宿主因子参与调控SARS-CoV-2进入，以及PSAP是否通过何种机制抑制病毒感染？
- 核心机制
- 分泌型PSAP与刺突蛋白RBD的非RBM区域结合，促进S1亚基从刺突蛋白上释放，从而阻断病毒进入，类似于中和抗体的机制。
- 主要证据
- cDNA过表达筛选鉴定PSAP；PSAP过表达、敲低和敲除实验证实其抑制假病毒和真实病毒感染；BLI测定显示PSAP与S1高亲和力结合（KD=1.279×10^-9 M）；Co-IP证实PSAP与RBD相互作用；ELISA和流式细胞术显示PSAP促进S1释放；分子对接显示PSAP结合于非RBM区域。
- 研究意义
- PSAP作为新的宿主限制因子，其作用机制为开发宿主导向的抗病毒策略提供基础，有望补充传统抗体疗法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PSAP对假病毒和真实病毒的抑制作用
确认PSAP的过表达、敲低、敲除以及外源蛋白对SARS-CoV-2感染的影响
通过Western blot检测PSAP过表达、敲低和敲除对假病毒GFP表达的影响；用纯化的PSAP-His蛋白与假病毒或真实病毒共孵育后感染多种细胞，检测病毒N基因表达。
PSAP与刺突蛋白的相互作用及亲和力测定
确定PSAP与刺突蛋白的结合区域和结合亲和力
通过Co-IP实验检测PSAP与全长刺突蛋白、S1、RBD等突变体的相互作用；使用BLI技术测定PSAP或ACE2与S1的结合动力学参数（KD值）。
评估PSAP对ACE2结合的影响及S1释放促进
验证PSAP是否竞争ACE2结合，以及是否促进S1亚基从刺突蛋白上释放
通过ELISA竞争实验检测PSAP对ACE2与S1结合的影响；通过流式细胞术和Western blot检测PSAP处理后细胞表面S1水平及培养基上清中S1含量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Corning | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 高内涵筛选 | 基质胶 | Corning | 354248 |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778100 |
| siRNA | Guangzhou RiboBio | -- | |
| CRISPR-Cas9基因编辑 | 潮霉素 | -- | -- |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693132001 |
| 硝酸纤维素膜 | Pall | 66485 | |
| 蛋白表达与纯化 | FreeStyle表达培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12338018 |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA柱 | GE Healthcare | -- |
| Superdex 200 Increase 10/300凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | -- | -- |
| 逆转录系统 | Promega | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| 流式细胞术 | Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG H&L抗体 | Abcam | ab150077 |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | P2545 |
| Pierce IP裂解液 | Thermo Fisher Scientific | 87788 | |
| 生物层干涉法 | 生物素蛋白标记试剂盒 | Roche | 11418165001 |
| 链霉亲和素传感器 | ForteBio | -- | |
| 蛋白纯化 | S1-His重组蛋白 | Sino Biological | 40591-V08H |
| ACE2-mFc重组蛋白 | Sino Biological | 10108-H05H | |
| RBD-hFc重组蛋白 | Sino Biological | 40592-V02H | |
| GST蛋白 | Sino Biological | 11213-HNAE | |
| 抗体 | 抗β-actin抗体 (A1978) | Sigma-Aldrich | A1978 |
| 抗Flag抗体 (F3165) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 抗GFP抗体 (G6795) | Sigma-Aldrich | G6795 | |
| 抗HA抗体 (H6908) | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| 抗ACE2抗体 (A12737) | ABclonal | A12737 | |
| 抗PSAP抗体 (10801-1-AP) | ProteinTech | 10801-1-AP | |
| 抗SARS-CoV-2 N蛋白抗体 (40143-R019) | Sino Biological | 40143-R019 | |
| 抗刺突蛋白抗体 (40591-T62) | Sino Biological | 40591-T62 | |
| 680RD标记的抗小鼠IgG (926-68072) | LI-COR Biotechnology | 926-68072 | |
| 800CW标记的抗兔IgG (926-32213) | LI-COR Biotechnology | 926-32213 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与病毒 | HEK293T和HEK293T-ACE2细胞培养条件（DMEM+10%FBS，ACE2细胞加1 μg/mL嘌呤霉素）；SARS-CoV-2真实病毒在Vero E6细胞中繁殖，TCID50测定滴度；假病毒包装使用pspax2、plenti-GFP和pCAGGS-spike共转染 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines; Viruses |
| cDNA筛选 | cDNA文库（10,001个基因）、293T-ACE2细胞接种密度（1×10^4/孔）、转染量（100 ng/孔）、假病毒感染时间（24小时）、polybrene浓度（8 μg/mL）、Z-score阈值（±3 SD） 阅读提示：Materials and Methods: High throughput screening; Results: Screening of host factors |
| PSAP过表达与敲低/敲除 | PSAP质粒剂量（0.2-1 μg）、siRNA浓度（50 nM）、CRISPR sgRNA序列（GCTTCTGGAGAGACTCGCAG）、潮霉素筛选浓度（50 μg/mL） 阅读提示：Materials and Methods: Transfection of plasmids and siRNAs; CRISPR-Cas9-mediated genome editing; Results: PSAP inhibits pseudovirus infection |
| 病毒感染实验 | 感染MOI（0.05）、感染时间（24小时）、PSAP-His蛋白浓度（0-100 μg/mL）、预孵育时间（37°C 1小时） 阅读提示：Materials and Methods: Viruses; Results: PSAP inhibits SARS-CoV-2 infection |
| 结合与机制实验 | Co-IP使用抗Flag抗体；BLI测量生物素化S1蛋白与PSAP/ACE2的结合；ELISA竞争实验使用S1-HA包被和不同浓度竞争蛋白；流式细胞术检测S1表面水平 阅读提示：Materials and Methods: Co-immunoprecipitation; Biolayer interferometry; Results: PSAP specifically interacts with the RBD; PSAP promotes S1 dissociation |