重组COBRA HA蛋白表达与表征
生成并验证COBRA H1和H3重组HA蛋白的正确表达、纯度和抗原性。
将COBRA HA序列克隆到pcDNA3.1+载体，转染HEK293T悬浮细胞，通过IMAC纯化，SDS-PAGE和Western blot验证。
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合成TRAC478乳剂和基于皂苷的佐剂系统增强计算优化的H1和H3血凝素亚单位疫苗诱导的体液和细胞免疫应答
Synthetic TRAC478 emulsion and saponin based adjuvant systems enhance humoral and cellular immune responses elicited by computationally optimized H1 and H3 hemagglutinin subunit vaccines.
实验完整度
高包含体外重组蛋白表达与表征、小鼠和雪貂两种动物模型的免疫原性评估，以及ELISA、HAI、ELISpot等多层次功能验证。
主要模型
BALB/c小鼠模型 Fitch雪貂模型
重点核对
BALB/c小鼠每组5只，共12组 Fitch雪貂每组6只，共11组 疫苗剂量：小鼠3 μg/rHA，雪貂15 μg/rHA 免疫方案：三次（小鼠）和两次（雪貂）肌肉注射 HAI检测使用0.8%火鸡红细胞（H1N1）和0.75%豚鼠红细胞（H3N2）
摘要
背景：当前的季节性流感疫苗诱导的免疫应答欠佳，使得病毒能够持续传播并导致疾病季节间流行。包含野生型疫苗抗原和经典的鸡胚制造工艺往往导致生产出的流感疫苗具有株特异性，与流行病毒匹配不良。方法：将计算优化的广谱反应性抗原（COBRAs）表达为重组血凝素（HA）蛋白，用作亚单位疫苗。这些COBRA HA疫苗与含有合成Toll样受体4（TLR4）和TLR7/8佐剂的乳剂系统TRAC478乳剂，或合成皂苷佐剂系统（SAS）联合，并在流感初始小鼠和预免疫雪貂队列中评估其诱导流感特异性体液和细胞免疫应答的能力。发现：在小鼠和雪貂模型中，佐剂化的COBRA H1和H3 HA疫苗候选物优于无佐剂HA亚单位疫苗，产生了更高水平的总IgG和血凝抑制（HAI）特异性抗体滴度，并诱导了更高频率的抗原特异性抗体和干扰素-γ（IFN-γ）分泌细胞。解释：这些结果强调了将广谱保护性疫苗候选物与现代佐剂系统相结合，以提高季节性流感疫苗对抗原漂移流感病毒株的有效性的潜在益处。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估TRAC478乳剂和SAS佐剂是否增强COBRA H1/H3 HA亚单位疫苗在小鼠和雪貂中诱导的体液和细胞免疫应答。
- 核心机制
- 佐剂通过激活TLR4和TLR7/8等模式识别受体，增强抗原呈递，促进Th1/Th2平衡的免疫应答，增加抗体产生和IFN-γ分泌细胞。
- 主要证据
- 在小鼠和雪貂中，佐剂化疫苗比无佐剂疫苗诱导更高的IgG和HAI滴度，并增加抗原特异性抗体分泌细胞和IFN-γ分泌细胞频率，尤其在SAS佐剂下显著。
- 研究意义
- 结合广谱疫苗和现代佐剂系统可能提高季节性流感疫苗对抗原漂移株的有效性，为流感疫苗改进提供方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
佐剂系统制备与表征
制备TRAC478乳剂和SAS佐剂并评估其理化性质。
TRAC478乳剂通过高剪切和高压均质制备，表征粒径和多分散性；SAS为TLR4激动剂和皂苷混合物。
小鼠免疫实验
评估佐剂化COBRA疫苗在流感初始小鼠中的免疫原性。
BALB/c小鼠分12组，肌肉注射疫苗三次，检测HAI滴度、总IgG、IgG亚类和ELISpot。
雪貂免疫实验
评估佐剂化COBRA疫苗在预免疫雪貂中的免疫原性。
雪貂先感染SG/86和PN/99病毒建立免疫史，再免疫两次疫苗，检测HAI滴度。
体液免疫应答评估
评估疫苗诱导的抗体滴度和亚型。
使用HAI和ELISA检测血清抗体滴度和IgG亚型。
细胞免疫应答评估
评估疫苗诱导的细胞免疫应答。
使用ELISpot检测脾细胞中IFN-γ分泌细胞和抗体分泌细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 重组蛋白表达 | pcDNA3.1+质粒载体 | Azenta Life Sciences | -- |
| HEK293T悬浮细胞 | Thermo Fisher | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| 重组蛋白表征 | rHA标准品A/California/07/2009 | Sino Biological | Cat#11055-V08H7 |
| rHA标准品A/Texas/50/2012 | Sino Biological | Cat#40354-V04B | |
| Western blot | 小鼠单克隆抗体抗HA | Immune Technology Corp | clone 15B7, Cat#IT-003-001M14 |
| 小鼠单克隆抗体抗HA | Immune Technology Corp | clone 34C9, Cat#IT-003-0423M13 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | Southern Biotech | -- | |
| Clarity ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| Chemi-Doc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 佐剂制备 | INI-2002 | Inimmune Corp. | -- |
| INI-4001 | Inimmune Corp. | -- | |
| 角鲨烯 | -- | -- | |
| DL-α-生育酚 | -- | -- | |
| 聚山梨酯80 | -- | -- | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 高剪切均质机L5M-A | Silverson | -- | |
| 微流化器LV1 | Westwood | -- | |
| PES滤膜0.8/0.2 μm | Millipore Sigma | -- | |
| 佐剂表征 | Zetasizer Nano-ZS仪器 | Malvern Panalytical | -- |
| Vanquish Flex超高效液相色谱仪 | Thermo Fisher | -- | |
| XSelect CSH C18色谱柱 | Waters | -- | |
| 病毒培养 | 火鸡红细胞 | Lampire Biological Laboratories | -- |
| 豚鼠红细胞 | Lampire Biological Laboratories | -- | |
| 奥司他韦羧酸盐 | Aobious | -- | |
| 动物实验 | BALB/c小鼠 | Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX: 000651 |
| Fitch雪貂 | Triple F Farms | -- | |
| 异氟烷 | -- | -- | |
| HAI检测 | 受体破坏酶 | Denka Seiken Co. | -- |
| ELISA | Immulon 4HBX 96孔微孔板 | Thermo Fisher | -- |
| 山羊抗小鼠IgG HRP | Southern Biotech | Cat#1030-05 | |
| 山羊抗小鼠IgG1 HRP | Southern Biotech | Cat#1070-05 | |
| 山羊抗小鼠IgG2a HRP | Southern Biotech | Cat#1083-05 | |
| ABTS二铵盐 | Millipore Sigma | -- | |
| SDS溶液 | Thermo Fisher | -- | |
| BioTek Epoch 2酶标仪 | Agilent | -- | |
| ELISpot | 合成多肽 | BEI Resources | NR-19245, NR-19266 |
| 小鼠ELISpot试剂盒 | Cellular Technology Limited | Cat#m IFN-γ/IL4-1M/10 | |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher | -- | |
| gentleMACS Octo组织处理器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Thermo Fisher | -- | |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 吐温20 | Thermo Fisher | -- | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | -- | |
| 二甲基亚砜 | Thermo Fisher | -- | |
| 小鼠B-Poly-S试剂 | Cellular Technology Limited | -- | |
| Triton X-100 | Sigma | -- | |
| 山羊抗小鼠IgG，人吸附-AP | Southern Biotech | Cat#1030-04 | |
| NBT/BCIP底物 | Thermo Fisher | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad | -- |
| Prism 10软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达 | COBRA HA序列（Y2, NG5, NG7, NG8），克隆载体pcDNA3.1+，转染细胞系HEK293T，纯化方法IMAC，蛋白浓度测定 阅读提示：Methods - Vaccine Antigens |
| 佐剂制备 | TRAC478乳剂组成（INI-4001, INI-2002, squalene, tocopherol, polysorbate-80），均质条件（高剪切、高压均质），粒径和PDI，终浓度（INI-4001: 400 μg/mL, INI-2002: 188.9 μg/mL） 阅读提示：Methods - Adjuvants, Preparation and characterization of TRAC478 emulsion |
| 小鼠免疫 | 小鼠品系（BALB/c），年龄（6-8周），性别（雌性），每组数量（5只），疫苗剂量（3 μg/rHA），佐剂剂量（TRAC478: 10 μg INI-4001, 4.7 μg INI-2002），免疫时间（0, 28, 56天） 阅读提示：Methods - Vaccination of Mice |
| 雪貂免疫 | 雪貂品系（Fitch），年龄（6-8月），性别（雌性），每组数量（6只），预免疫病毒感染（SG/86和PN/99, 5×10^5 PFU/mL），疫苗剂量（15 μg/rHA），佐剂剂量（TRAC478: 50 μg INI-4001, 23.61 μg INI-2002），免疫时间（60, 88天） 阅读提示：Methods - Vaccination of Ferrets |
| HAI检测 | 红细胞类型（H1N1: 0.8%火鸡RBC; H3N2: 0.75%豚鼠RBC），病毒稀释（8 HAU/50 μL），孵育时间（20分钟 H1N1, 30分钟 H3N2），RBC孵育（30分钟 H1N1, 1小时 H3N2） 阅读提示：Methods - Hemagglutination Inhibition Assay |