全基因组CRISPR/Cas9筛选
无偏筛选调节CD8+ T细胞PD-1表达的基因和通路
将全基因组gRNA文库感染Cas9-EGFP/OT-I小鼠的CD8+ T细胞，经Ova肽刺激和共培养，分选PD-1高表达和低表达细胞，通过测序分析富集的gRNA。
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离体和体内CRISPR/Cas9筛选确定蛋白质N-糖基化在调节T细胞活化和功能中的作用
Ex vivo and in vivo CRISPR/Cas9 screenings identify the roles of protein N-glycosylation in regulating T-cell activation and functions.
实验完整度
高包含离体和体内CRISPR筛选、体外杀伤、体内肿瘤模型、蛋白质组学和机制验证（如FRET和融合蛋白）等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠原代CD8+ T细胞（Cas9-EGFP/OT-I） B16F10-OVA荷瘤小鼠模型 人原代CD8+ T细胞 TCGA患者队列
重点核对
B4galt1 sgRNA敲除效率（T7E1实验） B4galt1敲除对TCR和CD8糖基化的影响（凝集素染色、Gal-1 pull-down） TCR-CD8相互作用（FRET实验） CD8β-CD3ε融合蛋白对杀伤功能的影响
摘要
细胞毒性CD8+ T细胞在肿瘤免疫治疗中发挥核心作用。理解调控细胞毒性CD8+ T细胞发育、分化和功能的机制，有助于开发更好的免疫疗法。通过结合原代T细胞培养和同系小鼠肿瘤模型，以及全基因组和定制CRISPR/Cas9筛选，我们系统地鉴定了调控PD-1表达和CD8+ T细胞功能的基因和途径。其中，糖缀合物生物合成中的关键酶——β1,4-半乳糖基转移酶1（B4GALT1）的失活，导致CD8+ T细胞的T细胞受体（TCR）活化和功能显著增强。有趣的是，抑制B4GALT1增强了TCR-T细胞的功能，但对嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞没有影响。我们通过亲和纯化和质谱分析，系统地鉴定了CD8+ T细胞表面B4GALT1的底物，包括TCR及其共受体复合物的蛋白质组分。TCR和CD8的半乳糖基化导致TCR和CD8之间的相互作用减弱，而这种相互作用对TCR活化至关重要。通过TCR-CD8融合蛋白人工连接TCR和CD8，可以绕过B4GALT1在CD8+ T细胞中的调控。最后，B4GALT1的表达水平（相对于肿瘤浸润的CD8+ T细胞归一化）与人类患者的预后显著负相关。我们的结果揭示了蛋白质N-糖基化在调节CD8+ T细胞功能中的重要作用，并证明B4GALT1是肿瘤免疫治疗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 蛋白质N-糖基化如何调控CD8+ T细胞的活化与功能？
- 核心机制
- B4GALT1通过催化TCR和CD8的半乳糖基化，减少TCR和CD8的相互作用，从而抑制TCR活化；B4GALT1失活导致TCR-CD8相互作用增强，促进T细胞功能。
- 主要证据
- 全基因组和定制CRISPR/Cas9筛选显示B4GALT1失活增强PD-1表达和T细胞杀伤；B4GALT1底物鉴定显示TCR和CD8是直接底物；FRET实验证实B4GALT1缺陷增强TCR-CD8相互作用；CD8β-CD3ε融合蛋白可绕过B4GALT1的调控。
- 研究意义
- B4GALT1是肿瘤免疫治疗的潜在靶点，抑制B4GALT1可能增强过继性T细胞疗法的效果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
定制文库离体筛选
验证全基因组筛选获得的高置信候选基因
构建含4617个gRNA的定制文库，感染T细胞后共培养，富集PD-1调节因子。
定制文库体内筛选
在肿瘤微环境中筛选调节CD8+ T细胞功能的基因
将定制文库感染的OT-I T细胞移植到荷B16F10-OVA肿瘤的小鼠中，7天后分离肿瘤浸润CD8+ T细胞进行gRNA测序。
B4GALT1敲除的表型验证
验证B4GALT1敲除对CD8+ T细胞活化和功能的影响
在OT-I T细胞中敲除B4galt1，检测PD-1表达、细胞因子分泌、体外杀伤能力；并在人TCR-T细胞中敲低B4GALT1验证保守性。
体内肿瘤模型验证
评估B4GALT1敲除对CD8+ T细胞抗肿瘤作用的影响
将B4galt1敲除或对照OT-I T细胞移植到荷瘤小鼠中，监测肿瘤生长、肿瘤浸润T细胞数量及增殖。
B4GALT1底物鉴定
鉴定CD8+ T细胞表面B4GALT1的直接底物
利用重组Gal-1亲和纯化与LC-MS分析，比较对照和B4galt1敲除OT-I T细胞的膜蛋白，鉴定差异蛋白。
机制验证
验证B4GALT1通过糖基化调控TCR-CD8相互作用的机制
通过凝集素和Gal-1染色分析糖基化变化；用FRET检测TCR-CD8相互作用；过表达CD8β-CD3ε融合蛋白检测是否能绕过B4GALT1对杀伤的影响。
临床相关性分析
评估B4GALT1表达与肿瘤患者预后的关联
分析TCGA数据中B4GALT1和CD8A表达与总体生存的关系，特别是在CD8A高表达患者中。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | HEK293T细胞 | ATCC | CRL-3216 |
| B16F10细胞 | ATCC | CRL-6475 | |
| Nalm6细胞 | ATCC | CRL-3273 | |
| A375细胞 | ATCC | CRL-1619 | |
| DMEM培养基 | Gibco | C11965500BT | |
| RPMI-1640培养基 | HyClone | -- | |
| 病毒制备 | Opti-MEM I减血清培养基 | Gibco | 31985-070 |
| 病毒增强剂 | Alstem Bio | VB100 | |
| 慢病毒浓缩试剂 | Takara | 631232 | |
| X-VIVO 15培养基 | Lonza | 04-418Q | |
| 细胞分选 | EasySep阴性选择试剂盒 | STEMCELL | 17953 |
| 小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒 | R&D | MAGM203 | |
| T细胞刺激 | 抗CD3/CD28磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 40203D |
| 细胞刺激 | 抗CD3抗体 | -- | 14-0031-86 |
| 抗CD28抗体 | -- | 102116 | |
| 流式分析 | APC抗小鼠CD8a抗体 | Invitrogen | 17-0081-83 |
| PE抗小鼠CD279(PD-1)抗体 | BioLegend | 109104 | |
| APC抗小鼠CD279(PD-1)抗体 | BioLegend | 109112 | |
| PE-链霉亲和素 | BioLegend | 405203 | |
| 生物素化刺桐凝集素 | -- | B-1145-5 | |
| 生物素化琥珀酰化麦胚凝集素 | -- | B-1025S-5 | |
| 生物素化重组半乳糖凝集素-1 | -- | -- | |
| APC抗人CD8a抗体 | BioLegend | 300912 | |
| ELISA | TNFα ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00027 |
| IFNγ ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00019 | |
| 人TNFα ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00030 | |
| 人IFNγ ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00015 | |
| TIL分离 | IV型胶原酶 | Invitrogen | V900893 |
| T细胞标记 | 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯 | Invitrogen | -- |
| 蛋白质组学 | 琼脂糖珠 | -- | GE17-0906-01 |
| 膜蛋白提取试剂盒 | -- | 89842Y | |
| 银染试剂盒 | Sigma | PROTSIL1 | |
| Western blot | 抗CD8b抗体 | Abcam | ab228965 |
| 抗Ly9抗体 | Abcam | ab252931 | |
| 抗Igf2g抗体 | Sino Biological | 107533-T40 | |
| 抗Itgal抗体 | Solarbio | K002895P | |
| 抗Itgb7抗体 | Solarbio | K004272P | |
| 抗Lnpep抗体 | Santa Cruz | sc-365300 | |
| 抗Sell抗体 | Santa Cruz | sc-390756 | |
| IRDye 680RD驴抗小鼠IgG | LI-COR | P/N | |
| IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG | LI-COR | P/N | |
| IRDye 680RD山羊抗兔IgG | LI-COR | P/N | |
| IRDye 800CW山羊抗兔IgG | LI-COR | P/N | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Ambion | 15596018 |
| ImProm-II逆转录酶系统 | Promega | A3801 | |
| TB Green预混Ex Taq | Takara | RR420A | |
| RNA-seq | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7530L |
| 测序平台 | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 质谱分析 | LTQ ORBITRAP Velos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 流式分选 | BD FACSAria流式细胞分选仪 | BD | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 离体筛选 | 小鼠品系（Cas9-EGFP/OT-I）、细胞密度（1x10^6/ml）、刺激（IL2 10 ng/ml，SIINFEKL 10 ng/ml）、感染条件（spin-infection 2000xg, 30°C, 1h）、筛选流程（puromycin 3 μg/ml） 阅读提示：Materials and methods: Ex vivo T memory cell culture, infection, and adoptive transfer; CRISPR/Cas9 screening |
| 体内筛选 | 肿瘤细胞接种量（4x10^5）、荷瘤天数（7天）、T细胞转移数量（2x10^6）、T细胞转移时间（第7天）、筛选时间（7天） 阅读提示：Materials and methods: Mouse tumor models and adoptive transfer experiments; CRISPR/Cas9 screening |
| B4GALT1功能验证 | 敲除方式（sgRNA）、共培养时间（8小时）、效靶比（4:1）、检测指标（PD-1, IFNγ, TNFα） 阅读提示：Figure 3 legend; Materials and methods: ELISA; In vitro targeted cell killing |
| 机制研究 | 蛋白提取方法（Mem-PER Plus Kit）、Gal-1亲和纯化条件和乳糖洗脱浓度（20 mM）、LC-MS鉴定条件 阅读提示：Materials and methods: Proteomic analysis of Gal-1 binding proteins in CD8+ T-cells; Figure 5 legend |