纳米抗体筛选与制备
从免疫骆驼的噬菌体展示文库中筛选特异结合RSV F蛋白的纳米抗体。
用DS-Cav1和DS2免疫骆驼，构建VHH噬菌体展示文库，经过两轮淘选和ELISA筛选，获得候选纳米抗体1G9和1D8，并在HEK293F细胞中表达为Fc融合或His标签形式。
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广泛中和纳米抗体靶向RSV融合蛋白上的一个明确的结构枢轴位点
Broadly neutralizing nanobodies target a defined structural pivot site on the RSV fusion protein.
实验完整度
高包含体外结合与中和、冷冻电镜结构解析、小鼠模型预防和治疗实验等多个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293F细胞表达的重组RSV Pre-F蛋白（DS-Cav1和DS2） Vero细胞中的RSV A2、RSV B（CH93(18)-18）和RSV Long株中和实验 BALB/c小鼠RSV A2感染模型
重点核对
纳米抗体1G9和1D8的Fc融合蛋白形式（1G9-Fc/1D8-Fc）用于中和和体内实验 中和实验所用RSV株：RSV A2、RSV B（CH93(18)-18）、RSV Long 预防实验剂量：2 mg/kg，腹腔注射，攻毒前24小时 治疗实验剂量：8 mg/kg，腹腔注射，攻毒后24小时 攻毒剂量：1×10^6 TCID50 RSV A2，鼻内接种
摘要
呼吸道合胞病毒（RSV）是婴儿和老年人急性下呼吸道感染的主要原因。尽管尼塞维单抗是近期针对RSV感染的一项突破，但耐药变异株的出现凸显了对额外抗病毒策略的需求。在此，我们报道两种靶向RSV融合（F）蛋白的纳米抗体（Nbs）1G9和1D8，它们对RSV亚型表现出高中和活性。在体内，Nbs-Fc展现出强大的预防和治疗效果。冷冻电镜揭示1G9和1D8特异性结合抗原位点IV内的一个构象枢轴位点，交联亚稳定的七肽重复B（HRB）和F蛋白构象稳定的结构域II。这种相互作用稳定了融合前构象，并阻止了膜融合所需的结构重排。值得注意的是，结合残基在RSV亚型间高度保守，这解释了观察到的广谱中和作用。总之，我们的发现识别了RSV F上一个结构保守且功能关键的表位，并强调1G9和1D8作为下一代针对RSV的预防和治疗干预措施的有前景候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找能克服现有RSV抗体局限性（如耐药、疗效有限）的下一代广谱中和抗体，并阐明其作用机制。
- 核心机制
- 纳米抗体1G9和1D8通过结合RSV F蛋白抗原位点IV内的构象枢轴位点，交联亚稳定的HRB区域和构象稳定的结构域II，锁定融合前构象，阻止膜融合所需的结构重排，从而抑制病毒进入。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构显示1G9和1D8结合于RSV Pre-F的抗原位点IV，交联HRB和结构域II；体外中和实验显示对RSV A2、RSV B和RSV Long有效；小鼠模型中1G9-Fc和1D8-Fc表现出预防和治疗效果，降低病毒RNA和滴度。
- 研究意义
- 揭示了RSV F上结构保守且功能关键的枢轴表位，为开发针对RSV的下一代预防和治疗干预措施提供了有前景的候选纳米抗体，特别是1G9已工程化YTE突变延长半衰期，并构建了1G9-IgA融合构建体用于吸入式治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
结合活性与特异性分析
检测纳米抗体与不同RSV F蛋白亚型的结合能力及特异性。
通过ELISA检测1G9和1D8与DS-Cav1、DS2、Post-F的结合亲和力，并检测对hMPV及其他病毒糖蛋白的非特异性结合；免疫荧光实验确认其与天然F蛋白的结合。
中和活性与融合抑制实验
评估纳米抗体对RSV不同亚型的中和能力以及阻断膜融合的能力。
采用中和免疫荧光实验测定1G9和1D8对RSV A2、RSV B（CH93(18)-18）、RSV Long的中和活性；通过融合抑制实验检测其在病毒附着后阻断膜融合的能力。
表位竞争分析
确定纳米抗体与已知RSV F蛋白表位抗体的竞争关系，定位其结合位点。
采用竞争ELISA，以已知表位的抗体（131-2a、palivizumab、MPE8、101F、hRSV90、nirsevimab）作为竞争抗体，分析1G9和1D8的结合位点。
冷冻电镜结构解析
解析纳米抗体与RSV Pre-F蛋白复合物的高分辨率结构，揭示结合表位和机制。
制备1G9或1D8与DS-Cav1复合物，用冷冻电镜采集数据并重构结构，分析相互作用界面和氢键网络。
小鼠体内预防和治疗效果评估
评估纳米抗体在RSV感染小鼠模型中的预防和治疗效果。
BALB/c小鼠分别于RSV A2攻毒前24小时（预防组，2 mg/kg）或攻毒后24小时（治疗组，8 mg/kg）腹腔注射纳米抗体或对照，攻毒后4天取肺和鼻甲组织，检测病毒RNA和滴度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | ThermoFisher | C11995500BT |
| 胎牛血清 | VivaCell | C04001-0500 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Biosharp | BL505A | |
| SMM293-TII-N培养基 | Sino Biological Inc. | RZ18JU-A | |
| 蛋白表达与纯化 | 聚乙烯亚胺 | MACKLIN | P924174-1g |
| NI-NTA亲和层析介质 | GeneBio | GBP005-50 | |
| Amicon Ultra超滤离心管 | Millipore | UFC901096 | |
| 蛋白纯化系统 | 微量蛋白纯化系统 | Union-Biotech (Shanghai) Co., Ltd | UEV 25D |
| 文库构建 | 电穿孔系统 | Bio-Rad | Gene Pulser Xcell™ |
| ELISA | TMB底物 | Beyotime | P0209-500 mL |
| ELISA板 | in vitro scientific | 100096H | |
| 兔抗人IgG-Fc HRP | Sino Biological | 10702-T16-H-100 | |
| 中和实验 | FITC标记的抗人IgG | Proteintech | SA00003-12 |
| 高通量成像 | ImageXpress Micro共聚焦高内涵成像系统 | Moleculardevices | 76177-140 |
| 冷冻电镜 | CRYO ARM 300电子显微镜 | JEOL | -- |
| K3直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| Vitrobot Mark IV冷冻制样仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗体制备 | Protein A亲和层析介质 | GeneBio | GBP001-50 |
| RNA提取 | E.Z.N.A.®总RNA提取试剂盒I | OMEGA | IR6834 |
| RT-PCR | HiScript II一步法qRT-PCR SYBR Green试剂盒 | Vazyme | Q221 |
| PrimeScript™ II第一链cDNA合成试剂盒 | Takara | 6210A | |
| RNA提取 | 病毒DNA/RNA提取试剂盒2.0 | Vazyme | RM401-04 |
| qPCR | Applied Biosystems QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪 | Thermo Scientific | A28137 |
| 蛋白浓度测定 | NanoDrop One微量分光光度计 | Thermo Scientific | 840-317400 |
| 对照抗体 | 帕利珠单抗 | Shanghai Universal Biotech Co., Ltd. | abs190405 |
| 尼塞维单抗 | AntibodySystem | DVV02802 | |
| 竞争ELISA | 抗体101F | AntibodySystem | RVV02816 |
| 抗体131-2a | AntibodySystem | RVV02818 | |
| 抗体MPE8 | AntibodySystem | RVV02814 | |
| 抗体hRSV90 | AntibodySystem | RVV02813 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 纳米抗体表达与纯化 | HEK293F细胞密度、转染试剂PEI用量、纯化缓冲液成分（20 mM Tris, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole pH 8.0等） 阅读提示：Methods部分：Antigen expression and purification |
| RSV中和实验 | Vero细胞接种密度、病毒与抗体孵育时间和温度、感染后培养时间、检测抗体F-E2-Fc浓度 阅读提示：Methods部分：RSV neutralization assay |
| 融合抑制实验 | 病毒附着温度和时间（4°C 1小时）、抗体稀释梯度、培养时间（60-72小时） 阅读提示：Methods部分：Fusion inhibition assay |
| 冷冻电镜结构解析 | 复合物摩尔比（1:3.6）、孵育条件（4°C过夜）、网格类型（R1.2/1.3 Cu 300 mesh）、Vitrobot设置（湿度100%，4°C，blot force 10，blot time 3.5s，wait 20s） 阅读提示：Methods部分：Cryo-EM sample preparation and data acquisition |
| 小鼠预防实验 | 小鼠品系和年龄（8周龄雌性BALB/c）、给药剂量（2 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、攻毒时间（给药后24小时）、攻毒剂量（1×10^6 TCID50） 阅读提示：Methods部分：Mouse study；Figure 7 legend |
| 小鼠治疗实验 | 给药剂量（8 mg/kg）、给药时间（攻毒后24小时）、其他同预防实验 阅读提示：Methods部分：Mouse study；Figure 7 legend |