合成与表征α-卤代硫代酰胺弹头
验证氧到硫交换策略的可行性并生成用于研究的弹头化合物。
通过酰化、氟化和硫代化反应合成了一系列氯代乙酰苯胺、氟代乙酰苯胺及其硫代类似物，并通过NMR和HRMS进行表征。
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α-卤代硫代酰胺弹头：增强半胱氨酸反应性和特异性，用于共价蛋白质标记
α-Halothioamide warheads with enhanced cysteine reactivity and specificity for covalent protein labelling.
实验完整度
高包含体外化学合成、GSH反应性测定、激酶抑制实验、蛋白MS/MS验证、细胞和化学蛋白质组学分析等多层级验证。
主要模型
重组人JAK3激酶结构域 重组人BTK激酶结构域 MAP2K6 Mino细胞系 trastuzumab抗体
重点核对
GSH反应性测定条件：250 μM片段与5 mM GSH在PBS缓冲液(pH 7.4)中25°C孵育 激酶抑制测定：100 μM探针与激酶预孵育60分钟后测定活性 JAK3抑制剂IC50测定：5分钟预孵育 Mino细胞裂解液中化学蛋白质组学实验：1或10 μM探针处理 抗体偶联实验：trastuzumab经TCEP还原后与100倍摩尔过量的炔基探针孵育
摘要
共价标记是一种有前景的策略，依赖于与靶标形成共价键的亲电弹头。在此，我们提出氧到硫交换策略，将传统的羧酰胺转化为硫代酰胺，产生亲电弹头，包括氯代硫代乙酰胺和氟代硫代乙酰胺，具有增强的半胱氨酸反应性，同时保持水稳定性和选择性。我们展示了它们在靶向Janus激酶3和Bruton酪氨酸激酶的靶向共价抑制剂开发中的实用性，当安装到相关支架上时，也用于抗体-药物偶联物的开发。接下来，通过定量化学蛋白质组学评估了炔基标记的α-卤代硫代酰胺探针。这些研究表明，氯代硫代乙酰胺探针优先标记蛋白质组的特定子集，导致Cys靶向共价磷酸二酯酶6δ标记并产生功能影响。我们讨论了氧到硫交换策略提供了替代的半胱氨酸特异性硫代酰胺衍生弹头，并能实现精确甚至后期调节共价反应性，强调了它们在共价探针设计以及药物化学和化学生物学应用中的前景。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过氧到硫交换策略提高半胱氨酸靶向共价弹头的反应性和选择性？
- 核心机制
- 氧到硫交换将酰胺转化为硫代酰胺，增强α-碳的亲电性，从而提高对半胱氨酸的反应性，同时保持水稳定性和选择性。
- 主要证据
- 通过DFT计算和实验GSH反应性测定验证反应性增强；在激酶抑制实验和MS/MS中证实共价标记；化学蛋白质组学显示氯代硫代乙酰胺探针优先标记特定蛋白质子集，并靶向PDE6δ Cys56。
- 研究意义
- 为共价探针设计提供新的弹头选择，并有望应用于靶向共价抑制剂和抗体-药物偶联物的开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估弹头的硫醇反应性和半胱氨酸选择性
评估氧到硫交换对半胱氨酸反应性和选择性的影响。
使用HPLC-based GSH反应性测定测量半衰期，并通过LC-MS/MS非肽选择性测定确认半胱氨酸选择性。
验证激酶靶标上的共价抑制
在蛋白质水平评估弹头的靶标共价标记能力。
使用Z'-LYTE激酶抑制试验评估片段对JAK3、BTK和MAP2K6的抑制活性，并通过完整蛋白MS和MS/MS分析确认共价标记位点。
开发靶向JAK3和BTK的共价抑制剂
将氧到硫交换策略应用于已知抑制剂以增强效力并保持选择性。
基于前期JAK3抑制剂和ibrutinib合成硫代类似物，测定IC50和结合动力学参数(kinact/KI)。
评估细胞内的靶点参与和选择性
评估硫代弹头在细胞环境中的靶点参与和蛋白组选择性。
合成炔基标记探针，在Mino细胞裂解液中进行化学蛋白质组学pull-down实验，并在Ramos细胞中测定MTT细胞活力。
验证抗体偶联
探索硫代弹头在抗体-药物偶联物中的应用。
将炔基探针共价连接到trastuzumab，通过click反应连接TAMRA，并评估偶联效率和稳定性。
蛋白质组学目标发现
评估硫代弹头在ABPP中的应用，发现新靶标。
使用炔基探针在HEK293裂解液中进行凝胶内和pull-down蛋白质组学，并验证PDE6δ的共价修饰。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证弹头的反应性和选择性
评估激酶抑制活性
计算化学反应能垒
化学蛋白质组学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| GSH反应性测定 | L-谷胱甘肽 | -- | 70-18-8 |
| 激酶抑制实验 | Z'-LYTE激酶抑制试验试剂盒 | Life Technologies | -- |
| JAK3激酶活性测定 | HitHunter激酶活性测定试剂盒 | DiscoverX | -- |
| JAK3激酶结构域 | MyBioSource | MBS2097317 | |
| BTK激酶活性测定 | BTK激酶 | -- | -- |
| 荧光偏振实验 | TAMRA-阿托伐他汀 (24) | -- | -- |
| 重组人PDE6δ | Novus Biologicals | NBP1-44480 | |
| MTT细胞活力实验 | PrestoBlue试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗体偶联 | 曲妥珠单抗 | MedChemExpress | HY-P9907 |
| 三(2-羧乙基)膦 | -- | 51805-53-3 | |
| TAMRA-PEG3-叠氮化物 | -- | -- | |
| TAMRA-叠氮化物 | -- | -- | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0705 | |
| SDS-PAGE | ProSieve QuadColor蛋白质标记物 | Lonza | -- |
| LC-MS | ACQUITY UPLC | Waters | -- |
| Triple TOF 5600+ | Sciex | -- | |
| QTRAP 6500 | AB Sciex | -- | |
| Exploris 240 | Thermo Scientific | -- | |
| HPLC-MS | 岛津LCMS-2020 | Shimadzu | -- |
| HRMS | Q-TOF Premier | Waters | -- |
| NMR | Varian Unity Inova 500 | Varian | -- |
| 柱色谱 | CombiFlash Lumen+ Rf | Teledyne ISCO | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | Biosera | -- | |
| 胎牛血清 | Biosera | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Biosera | -- | |
| Accutase | -- | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Biosera | -- | |
| 免疫染色 | 牛血清白蛋白 | -- | -- |
| Hoechst染料 | Sigma | -- | |
| ProLong抗淬灭封片剂 | Thermo Scientific | -- | |
| 纤连蛋白 | Sigma | -- | |
| 二抗 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GSH反应性测定 | 片段浓度250 μM、GSH浓度5 mM、缓冲液PBS pH 7.4、温度25°C 阅读提示：Methods: Thiol reactivity assay |
| 选择性测定 | 片段浓度1 mM、非肽浓度100 μM、乙腈比例10%、孵育时间16或24小时 阅读提示：Methods: Oligopeptide selectivity assay |
| 激酶抑制实验 | 探针浓度100 μM、预孵育时间60分钟、激酶种类 阅读提示：Methods: Z'-LYTE kinase inhibition assay |
| JAK3 IC50测定 | JAK3浓度0.05 μg/mL、预孵育时间5分钟、底物浓度1.25 mM、ATP浓度100 μM 阅读提示：Methods: Kinase activity assay of Janus kinase 3 (JAK3) |
| BTK IC50测定 | 预孵育时间1、2、5或15分钟 阅读提示：Methods: Kinase activity assay of Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) |
| 完整蛋白MS | BTK: 20当量探针，4°C孵育20小时；JAK3: 170当量探针，25°C孵育60分钟；MAP2K6: 70当量探针，37°C孵育60分钟 阅读提示：Methods: LC/MS of labelled BTK, JAK3, MAP2K6 |
| 化学蛋白质组学pull-down | 探针浓度1或10 μM，裂解液类型，孵育时间1小时 阅读提示：Methods: Pull-down proteomics experiments on Mino lysate with probes 16-18 |
| 抗体偶联 | trastuzumab 10 μM、TCEP 40当量、探针100当量、37°C孵育1小时 阅读提示：Methods: Antibody conjugation |
| MTT实验 | Ramos细胞、细胞密度5000细胞/孔、处理时间5天 阅读提示：Methods: MTT assay |