评估TER对PD-L1表达的影响
确定TER是否调节结直肠癌细胞中的PD-L1表达及其机制。
用不同浓度TER处理DLD-1、HCT116和RKO细胞，Western blot检测PD-L1蛋白水平；用IFN-γ预处理后检测PD-L1 mRNA和蛋白表达。
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特立氟胺调节PD-1/PD-L1轴并增强结直肠癌的抗肿瘤免疫
Teriflunomide modulates the PD-1/PD-L1 axis and enhances antitumor immunity in colorectal cancer.
实验完整度
高包含体外细胞实验、分子互作分析、人源化小鼠模型、CD8+T细胞耗竭实验等多层级功能与机制验证。
主要模型
人结直肠癌细胞系：DLD-1、HCT116、RKO hPD-1 Jurkat-T细胞与hPD-L1 CHO-K1细胞共培养体系 hPD-1敲入小鼠移植hPD-L1 MC38肿瘤模型 hPD-L1 MC38细胞与肿瘤浸润CD8+T细胞共培养体系
重点核对
TER处理浓度与时间（例如：0–100 μM，24 h或72 h） 体外细胞系种类（DLD-1、HCT116、RKO、hPD-1 Jurkat-T、hPD-L1 CHO-K1、hPD-L1 MC38） 体内实验中TER给药剂量（10和30 mpk）及给药方式（腹腔注射） CD8+T细胞耗竭实验的分组设计（同型对照 vs CD8耗竭抗体） 用于验证的关键试剂（竞争性ELISA试剂盒、SPR传感器芯片等）
摘要
针对程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）免疫检查点通路的抑制剂已经革新了癌症免疫治疗；然而，许多患者的应答有限。在本研究中，我们考察了特立氟胺（TER）——一种FDA批准用于多发性硬化症的药物——作为治疗结直肠癌（CRC）的新型免疫检查点调节剂的潜力。我们确定了TER对人CRC细胞系中PD-L1表达的影响、其与PD-1的直接结合，以及其对CD8+ T细胞功能的影响。使用植入表达hPD-L1的MC38肿瘤细胞的人源化hPD-1敲入小鼠模型，在体内评估了抗肿瘤活性。TER处理降低了CRC细胞中PD-L1的表达，并直接破坏了PD-1/PD-L1相互作用。在体内，TER显著抑制了肿瘤生长而未产生全身毒性，并增强了肿瘤内CD8+ T细胞的浸润和活化，这通过颗粒酶B表达的增加得以证实。此外，TER的抗肿瘤功效被CD8+ T细胞的耗竭所消除，表明其依赖于这一细胞群体。这些发现凸显了TER作为一种有前景的免疫检查点调节剂，靶向PD-1/PD-L1轴以促进CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫。鉴于其已确定的安全性特征，TER是一种易于转化用于增强CRC癌症免疫治疗的药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估FDA批准的多发性硬化症药物特立氟胺是否能够作为免疫检查点调节剂，通过靶向PD-1/PD-L1轴增强结直肠癌的抗肿瘤免疫。
- 核心机制
- TER直接结合PD-1受体，阻断PD-1/PD-L1相互作用；同时通过溶酶体途径促进PD-L1蛋白降解，从而双重抑制PD-1/PD-L1轴，恢复CD8+ T细胞功能。
- 主要证据
- 体外实验显示TER降低PD-L1蛋白表达并促进其溶酶体降解；SPR实验证实TER与PD-1高亲和力结合；体内人源化小鼠模型显示TER抑制肿瘤生长、增加CD8+ T细胞浸润和颗粒酶B表达，且CD8+ T细胞耗竭消除其抗肿瘤效果。
- 研究意义
- TER作为一种已获批药物，有望被重新定位用于增强癌症免疫治疗，尤其对传统PD-1/PD-L1抑制剂无应答的结直肠癌患者，可能提供新治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析PD-L1降解途径
阐明TER下调PD-L1蛋白的分子机制。
用CHX追踪实验检测PD-L1蛋白稳定性；使用MG132、巴弗洛霉素A1和氯喹处理RKO细胞，评估溶酶体和蛋白酶体抑制对PD-L1降解的影响；通过免疫沉淀分析PD-L1泛素化水平。
验证TER对PD-1/PD-L1相互作用的影响
确定TER是否直接干扰PD-1与PD-L1的结合。
用免疫荧光法检测TER处理对RKO细胞与重组人PD-1蛋白结合的影响；用竞争性ELISA测定TER抑制PD-1/PD-L1结合的效力；通过分子对接和SPR验证TER与PD-1的直接结合。
评估TER对T细胞活化的影响
确定TER阻断PD-1/PD-L1轴是否恢复T细胞功能。
建立hPD-1 Jurkat-T细胞与hPD-L1 CHO-K1细胞的共培养体系，使用PD-1/PD-L1阻断生物测定检测NFAT驱动的荧光素酶活性。
检测TER增强CD8+ T细胞杀伤活性
验证TER是否增强CD8+ T细胞对结直肠癌细胞的细胞毒性。
从hPD-1敲入小鼠的MC38肿瘤中分离CD8+ T细胞，与hPD-L1 MC38细胞共培养并加入TER，测定癌细胞存活率；Western blot检测PD-L1表达；ELISA检测共培养上清中免疫因子水平。
体内评估TER抗肿瘤效果
评估TER在体内的抗肿瘤活性及其对免疫微环境的调节作用。
在hPD-1敲入小鼠中皮下移植hPD-L1 MC38细胞，给予TER（10或30 mpk）或赋形剂，测量肿瘤体积和重量；流式细胞术分析肿瘤浸润CD8+ T细胞比例；Western blot检测PD-L1表达；IHC染色检测CD8和GrB。
验证CD8+ T细胞依赖性
确认TER的抗肿瘤效应依赖于CD8+ T细胞。
在体内模型中，使用CD8耗竭抗体或同型对照，比较TER治疗组中肿瘤生长的差异；流式细胞术确认CD8+ T细胞耗竭，并通过IHC检测CD8和GrB表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 特立氟胺 | Targetmol | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone Laboratories Inc. | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞活力测定 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| Bio-Rad蛋白定量试剂 | Bio-Rad | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | -- | |
| ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| qRT-PCR | RiboEx总RNA提取试剂盒 | GeneAll Biotechnology | -- |
| AccuPower CycleScript RT预混液 | Bioneer | -- | |
| AccuPower 2X Greenstar qPCR预混液 | Bioneer | -- | |
| QuantStudio 3D数字PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 竞争性ELISA | PD-1/PD-L1抑制剂ELISA筛选试剂盒 | BPS Bioscience | 72005 |
| 重组人PD-L1蛋白 | BPS Bioscience | 71104 | |
| 生物素化人PD-1蛋白 | BPS Bioscience | 71109 | |
| SpectraMax L发光检测仪 | Molecular Devices | -- | |
| PD-1/PD-L1阻断生物测定 | PD-1/PD-L1阻断生物测定试剂盒 | Promega | J4011 |
| GloMax Explorer多功能酶标仪 | Promega | -- | |
| Bio-Glo试剂 | Promega | G7940 | |
| TILs分离 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| 细胞筛网（100 μm、40 μm） | SPL | -- | |
| 共培养实验 | Dynabeads T细胞活化磁珠CD3/CD28 | Life Technologies | -- |
| CellTrace Far Red细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 体内实验 | CD8耗竭抗体 | Bio Cell | BP0061 |
| 流式细胞术 | PerCP/Cyanine5.5抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103131 |
| APC抗小鼠CD8a抗体 | BioLegend | 100712 | |
| PerCP/Cy5.5大鼠IgG2b同型对照 | BioLegend | 400632 | |
| APC大鼠IgG2a同型对照 | BioLegend | 400512 | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman | -- | |
| SPR分析 | Biacore T200生物传感器 | GE HealthCare | -- |
| NTA传感器芯片 | GE HealthCare | -- | |
| 重组人PD-1蛋白 | Sino Biologicals | 10377-H08H | |
| 统计软件 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力测定 | 细胞密度（1×10^4），TER浓度范围，处理时间，CCK-8溶液体积 阅读提示：Materials and methods: Cell viability assay; Figure 1A |
| Western blot | TER处理浓度和时间，细胞裂解液配方，凝胶浓度，Primary抗体来源 阅读提示：Materials and methods: Western blotting analysis; Figure 1B, 1D |
| 竞争性ELISA | 试剂盒型号（#72005），hPD-L1包被浓度，hPD-1浓度，洗涤步骤，显色检测方法 阅读提示：Materials and methods: Competitive ELISA |
| PD-1/PD-L1阻断生物测定 | 细胞密度，TER浓度，共培养时间（72h），荧光素酶检测方法 阅读提示：Materials and methods: PD-1/PD-L1 blockade bioassay; Figure 5 |
| 共培养实验 | 效靶比（5:1），TER浓度，处理时间（72h），IFN-γ预处理浓度和时间 阅读提示：Materials and methods: Co-culture experiments; Figure 6 |
| 体内实验 | 小鼠品系（hPD-1敲入），细胞注射数，TER剂量（10/30 mpk），给药方式，治疗周期，CD8耗竭抗体频率 阅读提示：Materials and methods: In vivo analysis; Figures 7-8 |