验证HMGB1在结肠黏液中的存在及释放
确定HMGB1是否构成结肠无细胞屏障的一部分及其来源。
利用人结肠组织免疫荧光染色检测HMGB1定位，比较健康对照与UC患者；使用HMGB1ΔIEC小鼠和GF小鼠验证HMGB1来源及微生物群对释放的影响。
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HMGB1在肠道黏膜屏障中作为宿主防御的关键介质发挥作用
HMGB1 functions as a critical mediator of host defense at the gut mucosal barrier.
实验完整度
高包含患者样本、小鼠模型、细胞实验、细菌遗传操作、生化结合实验及体内外功能验证。
主要模型
人类结肠组织（对照及溃疡性结肠炎患者） 小鼠模型（HMGB1WT及HMGB1ΔIEC） Caco2细胞（WT及ΔHMGB1） E. coli（SWW33、BW25113等）及E. faecalis
重点核对
HMGB1在结肠黏液中响应微生物群释放（GF vs SPF小鼠） HMGB1与FimH的ToH1序列结合（Kd=62.84 nM） HMGB1抑制细菌黏附及侵袭（Caco2及纤维连接蛋白黏附实验） HMGB1抑制FimH表达（体外及HMGB1ΔIEC小鼠） UC患者黏膜HMGB1减少与FimH阳性细菌增加相关
摘要
宿主细胞和细菌不断地通过肠道黏膜屏障进行交流，然而这些相互作用的分子细节在很大程度上仍然未知。在这里，我们报道了高迁移率族蛋白B1（HMGB1）与表达一个进化上保守的氨基酸序列——HMGB1靶标（ToH1）的细菌之间的一个分子反馈环路。HMGB1响应微生物群而被释放到结肠黏液中，在那里它与细菌表面的含有ToH1的蛋白质结合。这种结合促进细菌聚集，限制黏膜侵袭，并阻断对宿主组织的黏附。遇到HMGB1的共生细菌随后下调表达携带ToH1的黏附素。在溃疡性结肠炎中，HMGB1防御受到损害，低HMGB1水平与ToH1阳性黏附细菌的富集相关。ToH1被广泛利用，对毒力至关重要，并在共生和致病状态之间差异表达。这些特征表明ToH1作为微生物毒力决定因子发挥作用，并可能作为开发精准靶向有毒力细菌的抗菌策略的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道黏膜屏障中宿主细胞与细菌之间相互作用的分子机制是什么？
- 核心机制
- HMGB1通过结合细菌黏附素上的保守ToH1序列，促进细菌聚集、限制黏膜侵袭、阻断黏附，并下调FimH表达，从而维持共生状态。
- 主要证据
- 体外实验（细菌聚集、黏附、侵袭、FimH表达）、小鼠模型（HMGB1ΔIEC）及UC患者样本显示HMGB1缺失导致细菌黏附增加。
- 研究意义
- 揭示HMGB1作为黏膜防御因子的新功能，ToH1可能成为精准靶向致病菌的抗菌策略靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估HMGB1对肠道细菌黏附及侵袭的影响
验证HMGB1是否直接作用于细菌以阻止其黏附宿主细胞。
使用HMGB1ΔIEC小鼠观察细菌分布，通过黏液侵袭实验、细胞黏附实验和纤维连接蛋白黏附实验检测HMGB1的作用。
鉴定HMGB1的细菌靶标
确定HMGB1结合的细菌表面分子及其氨基酸序列。
基于先前HMGB1结合基序，利用生物信息学搜索和实验验证FimH及Asa1中的ToH1序列，通过流式细胞术和标记转移实验确认结合。
验证HMGB1通过ToH1抑制细菌黏附功能
确认HMGB1结合ToH1后是否抑制细菌黏附活性。
通过细胞黏附、红细胞凝集及甘露糖结合实验检测rHMGB1对FimH介导黏附的影响，并有ToH1突变体验证其必要性。
评估HMGB1对IEC损伤的保护作用
验证HMGB1是否保护肠上皮细胞免受细菌诱导的损伤和死亡。
将ΔHMGB1 Caco2细胞暴露于细菌及rHMGB1，检测Caspase-3/7活化及膜完整性。
验证HMGB1对细菌FimH表达的调控
确定HMGB1是否下调细菌黏附素FimH的表达。
体外用rHMGB1处理E. coli检测FimH表达，使用ΔFimE菌株观察相变开关；体内比较HMGB1WT及HMGB1ΔIEC小鼠的FimH表达。
分析UC患者中的HMGB1与细菌关联
确定UC患者中HMGB1水平与ToH1阳性细菌的关系。
对UC患者和对照结肠组织进行免疫荧光染色，量化HMGB1和FimH阳性细菌，并进行相关性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 胰蛋白酶/EDTA | -- | -- | |
| 细菌培养 | 细菌蛋白胨 | VWR | -- |
| 牛肉提取物 | VWR | -- | |
| 氯化钠 | Fisher | -- | |
| 琼脂 | Fisher | -- | |
| 脑心浸液肉汤 | Thermo Scientific | -- | |
| 细胞处理 | 重组HMGB1 | R&D systems | -- |
| 苦马豆素 | Cayman Chemical | -- | |
| 甘露糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 蛋白表达 | TransIT-293转染试剂 | Mirus Bio | -- |
| 抗DYKDDDDK亲和树脂 | Pierce | -- | |
| PD-10脱盐柱 | Cytiva | -- | |
| Amicon超滤离心管 | Millipore | -- | |
| 免疫染色 | Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | 23491-45-4 |
| 抗HMGB1抗体 | Abcam | ab79823 | |
| 抗FimH抗体 | Genscript | Custom | |
| 抗Mucin 2抗体 | Novus | NBP1-31231 | |
| Alexa Fluor 647 Tyramide SuperBoost试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | B40926 | |
| 二抗 | Jackson Immunoresearch | -- | |
| 免疫印迹 | NuPAGE Bis-Tris凝胶 | Fisher | -- |
| MOPS SDS电泳缓冲液 | Fisher | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| IRDye 680LT驴抗兔二抗 | LI-COR | 926-68023 | |
| IRDye 800CW驴抗鼠二抗 | LI-COR | 926-32212 | |
| 流式细胞术 | SYTO 9 | Invitrogen | -- |
| PE抗人IgG Fc抗体 | Biolegend | 366903 | |
| PE-Cy7抗小鼠IgG1二抗 | Invitrogen | 25-4015-82 | |
| ELISA | HMGB1检测试剂盒 | Chondrex, Inc | 6010 |
| DNA提取 | DNeasy Powerlyzer微生物DNA提取试剂盒 | Qiagen | 12255-50 |
| PCR | PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | A25777 |
| SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 172-51240 | |
| PCR仪器 | CFX96 Touch实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | CFX96 |
| 罗氏LightCycler 480系统 | Roche | -- | |
| 细菌黏附实验 | 纤维连接蛋白包被板 | R&D Systems | CWP001 |
| 甘露糖包被板 | Glycomatrix | 20140039-1 | |
| 细胞培养 | 0.4 μm聚酯膜Transwell小室 | Corning | 3470 |
| 细胞活性检测 | 碘化丙啶 | Alfa Aesar | J66764MC |
| 细胞凋亡检测 | CellEvent Caspase-3/7红色检测试剂 | Invitrogen | C10430 |
| 标记转移实验 | Sulfo-SBED | Thermo Scientific | 33033 |
| EZ-link NHS-生物素 | Thermo Scientific | 20217 | |
| 荧光成像 | 宽场荧光显微镜 | Keyence | BZ-800 |
| 倒置共聚焦显微镜 | Leica | TCS-SP8-AOBS | |
| 化学发光成像 | Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | 12003154 |
| 荧光成像 | Odyssey CLx成像系统 | LI-COR | CLx |
| 流式细胞术 | Attune NxT流式细胞仪 | Invitrogen | -- |
| Image Stream MarkII | Amnis | -- | |
| 酶标仪 | BioTek Synergy HTX多功能酶标仪 | Agilent | -- |
| 其他 | μ-Slide趋化载玻片 | Ibidi | 80326 |
| μ-Slide 8孔高壁载玻片 | Ibidi | 80806 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠基因型（HMGB1WT/ΔIEC）、SPF或GF状态、年龄（6-12周）、性别 阅读提示：STAR Methods - Experimental Model and Study Participant Details: Mice |
| 细胞培养 | Caco2细胞（WT及ΔHMGB1）来源、培养条件（DMEM, 10% FBS, 37°C, 5% CO2） 阅读提示：STAR Methods - Experimental Model and Study Participant Details: Caco2 Cell culture |
| 细菌培养 | E. coli菌株（SWW33, BW25113, ΔFimH, ΔFimE）培养条件、FimH诱导条件（静态培养） 阅读提示：STAR Methods - Method Details: Bacterial aggregation Assays |
| 重组蛋白 | rHMGB1来源（R&D, Abclonal, Genscript, 自制）、浓度（通常3 μM） 阅读提示：STAR Methods - Method Details: Recombinant proteins |
| 黏附实验 | 细菌与细胞比例（MOI）、孵育时间（1小时）、rHMGB1浓度（3 μM） 阅读提示：STAR Methods - Method Details: Intestinal epithelial cell adhesion assays |