抗体发现与筛选
通过免疫小鼠和噬菌体展示技术生成结合PlGF-2或VEGFA165的抗体，并筛选出具有不同结合特性的克隆。
用重组人PlGF-2免疫BALB/c小鼠，构建scFv噬菌体文库，通过不同淘选策略（针对PlGF-2、跨物种、交替）筛选，经单克隆噬菌体ELISA鉴定出9个独特scFv克隆（C1-C9），并转化为嵌合人IgG1/κ抗体。
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阻断PlGF或VEGF与NRP1受体相互作用的抗体介导抗增殖效应
Antibodies blocking PlGF or VEGF interactions with the NRP1 receptor mediate antiproliferative effects.
实验完整度
高包含抗体发现（噬菌体展示）、生化结合与阻断分析（ELISA、BLI）、体外功能验证（HUVEC管形成、Caki-I增殖与迁移）及机制探讨（表位分箱、竞争实验），多层次验证。
主要模型
HUVEC（人脐静脉内皮细胞） Caki-I肾透明细胞癌细胞系 BALB/c小鼠免疫模型
重点核对
抗体阻断NRP1或VEGFR1结合的能力需通过竞争ELISA和BLI实验验证 HUVEC管形成实验中Matrigel批号与浓度、细胞代数（<16）及抗体浓度范围（0.01-10 μg/ml）需核对 Caki-I增殖实验中血清饥饿时间（24h）、抗体与生长因子预孵育浓度（2.5或5 μg/ml抗体；12.5或50 ng/ml生长因子）及检测时间（72h）需核对 细胞迁移实验中HUVEC条件培养基制备、抗体浓度（10 μg/ml）及孵育时间（16h）需核对
摘要
阻断血管内皮生长因子A（VEGFA）功能的抗体仍然是一种有前景的治疗策略，尤其是与检查点抑制剂联合使用时，但其疗效受到肿瘤耐药性的限制。耐药性可通过多种机制发生，包括上调胎盘生长因子2（PlGF-2），它是VEGF受体1（VEGFR1）和神经纤毛蛋白受体1（NRP1）的替代配体。这两种生长因子的活性均通过与多种受体和细胞外基质成分的相互作用介导，这使得理解它们对癌症进展的贡献变得复杂。为了解决这一问题，我们旨在发现新的抗体，在肝素存在下精确阻断PlGF-2或VEGFA与NRP1的结合，以补充现有的研究PlGF和VEGFA生物学功能的资源。限制血管生成以促进血管正常化是抗VEGF保护的一种机制；在此，阻断与VEGFR1和NRP1相互作用的抗VEGFA抗体在生理性血管生成模型中减少了HUVEC管形成。相比之下，结合PlGF-2或VEGFA以阻断NRP1的抗体显著降低了Caki-I肾癌细胞体外的增殖和迁移，表明该受体介导额外效应。有趣的是，一种抗体表现出与VEGFA和PlGF-2的双重反应性结合，提示了一种新的治疗策略来预防PlGF驱动的VEGF耐药性。总体而言，这些抗体定义了破坏PlGF活性的新机制，并支持NRP1在细胞增殖中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何精准阻断PlGF-2或VEGFA与NRP1的相互作用，以定义NRP1在肿瘤细胞增殖和血管生成中的功能？
- 核心机制
- NRP1作为共受体介导PlGF-2和VEGFA的促增殖和促迁移信号，抗体通过阻断NRP1结合来抑制这些活性。
- 主要证据
- C1和C7分别强效阻断PlGF-2和VEGFA165与NRP1的结合，并在Caki-I细胞增殖和迁移实验中抑制生长，且C7和C6抑制HUVEC管形成。
- 研究意义
- 这些抗体为研究PlGF和VEGFA生物学提供了工具，并可能为设计抗VEGF耐药的新型治疗策略提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抗体结合与受体阻断分析
评估抗体与不同生长因子亚型的结合能力，以及阻断NRP1和VEGFR1受体结合的效果，并确定表位竞争关系。
通过ELISA检测抗体与PlGF-2、PlGF-1、mPlGF-2、VEGFA165、VEGFA121的结合；通过竞争ELISA检测抗体对NRP1和VEGFR1结合的抑制；通过BLI进行表位分箱和亲和力测量。
HUVEC管形成实验
评估抗VEGF抗体对VEGF介导的血管生成的抑制作用，并比较不同NRP1阻断抗体的效果。
在Matrigel上培养HUVEC，加入抗体（10-0.01 μg/ml）或对照，16-18小时后成像，分析网状结构和分支间隔。
Caki-I细胞增殖实验
评估抗PlGF和抗VEGF抗体对生长因子刺激的肾癌细胞增殖的影响，以确定NRP1在肿瘤细胞生长中的作用。
Caki-I细胞血清饥饿24小时后，用抗体与生长因子（PlGF-2或VEGFA165）预孵育后刺激72小时，加入刃天青孵育48小时，测量荧光。
Caki-I细胞迁移实验
验证NRP1阻断抗体对肾癌细胞迁移的影响，评估其在肿瘤转移中的潜在作用。
使用Transwell小室，下室为HUVEC条件培养基，上室接种Caki-I细胞，加入抗体（10 μg/ml），16小时后染色、成像和计数。
免疫沉淀验证
确认HUVEC条件培养基中存在PlGF和VEGF，支持迁移实验的合理性。
收集HUVEC条件培养基，用C5和C7抗体免疫沉淀，通过SDS-PAGE和Western blot检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物免疫 | 重组人PlGF-2 | R&D Systems | -- |
| 弗氏完全佐剂 | Sigma Aldrich | -- | |
| 弗氏不完全佐剂 | Sigma Aldrich | -- | |
| 文库构建 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PureLink RNA提取试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| SuperScript IV逆转录酶试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 噬菌体展示 | M13K07辅助噬菌体 | New England Biolabs | -- |
| 抗myc标签抗体 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 蛋白表达与纯化 | ExpiCHO表达系统 | ThermoFisher Scientific | -- |
| ExpiHEK表达系统 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Freestyle 293F细胞 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 蛋白纯化 | ÄKTA Pure FPLC系统 | Cytiva | -- |
| HiTrap Protein A HP层析柱 | Cytiva | -- | |
| CaptureSelect CH1-XL亲和基质 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Strep-Tactin XT树脂 | IBA Lifesciences | -- | |
| ELISA | TMB底物 | ThermoFisher Scientific | -- |
| SpectraMax M5酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-生物素化试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 竞争ELISA | 肝素 | Fisher | BP252410 |
| BLI | Forte Bio Octet系统 | Sartorius | -- |
| 细胞培养 | HUVEC-GFP细胞 | Angio Proteomie | -- |
| EGM-2完全培养基 | Lonza | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Corning | -- | |
| DMEM培养基 | Corning | -- | |
| 管形成实验 | 基质胶（生长因子减少型） | Corning | -- |
| Ibidi 96孔μ板 | Ibidi | -- | |
| EVOS细胞成像系统 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | 抗VEGFR1抗体 | Invitrogen | RRID:AB_2609308 |
| 抗VEGFR2抗体 | R&D Systems | RRID:AB_2132190 | |
| 抗NRP1抗体 | Sino Biological | Cat # 1011-MM01 | |
| LSRFortessa SORP流式细胞仪 | BD | -- | |
| Attune NxT流式细胞仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 增殖实验 | 刃天青 | R&D Systems | -- |
| 免疫沉淀 | Pierce Protein A/G磁珠 | ThermoFisher Scientific | -- |
| DynaMag-2磁力架 | Invitrogen | -- | |
| Mini-Protean TGX预制胶 | BioRad | -- | |
| 迁移实验 | Transwell小室（8 μm孔径） | Falcon | -- |
| EVOS M7000细胞成像系统 | ThermoFisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体发现与筛选 | 免疫所用PlGF-2来源、小鼠品系、免疫剂量、佐剂类型、噬菌体文库构建方法、淘选策略及抗体表达系统 阅读提示：Experimental procedures部分：Mouse immunization、Library generation、Phage display、Protein expression constructs |
| 生化结合与阻断分析 | ELISA包被抗原浓度、竞争ELISA中生物素化受体浓度、肝素浓度、BLI中抗体和生长因子浓度 阅读提示：Experimental procedures部分：ELISA to assess antibody binding, Competition ELISAs, Antibody binding kinetics & epitope binning |
| HUVEC管形成实验 | HUVEC代数（<16）、Matrigel用量、细胞接种数、抗体浓度范围、孵育时间 阅读提示：Experimental procedures部分：HUVEC tube formation assay |
| Caki-I增殖实验 | 血清饥饿时间（24h）、细胞接种数、抗体与生长因子预孵育条件、刺激时间（72h）、刃天青孵育时间（48h） 阅读提示：Experimental procedures部分：Cell proliferation assay |
| Caki-I迁移实验 | HUVEC条件培养基制备、Transwell孔径、细胞接种数、抗体浓度（10 μg/ml）、孵育时间（16h） 阅读提示：Experimental procedures部分：Cell migration assay |