iCAR信号域筛选
评估不同抑制性信号域对iCAR功能的影响，以选择最佳抑制域。
构建21种不同信号域的iCAR（来自抑制性受体、酪氨酸磷酸酶、泛素连接酶），与28ζ aCAR共转导至T细胞，通过抗原板结合实验检测IFNγ、CD69和IL-2，以相对抑制和相对激活指标评估。
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T细胞和NK细胞中的NOT门控嵌合抗原受体电路
NOT-gated chimeric antigen receptor circuits in T and NK cells.
实验完整度
高包含体外抗原板结合实验、细胞杀伤实验、体内异种移植模型（T和NK细胞）以及机制研究（SHP-1敲除、顺式/反式实验）等多层级验证。
主要模型
原代人T细胞 原代NK细胞 Nalm6细胞系（ON-Tumor与OFF-Tumor模型） NSG小鼠异种移植模型
重点核对
aCAR的CD3ζ变体（28ζ、28ζ(D23)、28ζ(1XX)、CD3ε-28ζ）对抑制效果的影响 iCAR的细胞内信号域（LIR1、LAIR1、CEACAM1等）和铰链域（如CD8WT）的选择 靶抗原（Axl和Her2）的表达及抗原剂量 体外杀伤实验的效靶比（E:T比） 体内模型中肿瘤细胞（ON-Tumor/OFF-Tumor）的注射时间和细胞数量
摘要
嵌合抗原受体（CAR）T细胞是强大的癌症免疫疗法，但大多数癌症缺乏肿瘤特异性单一抗原，限制了治疗窗口。NOT门控CAR电路由激活型CAR（aCAR）和抑制型CAR（iCAR）组成，其特别强大之处在于能够启用新的抗原集合用于肿瘤靶向。我们系统评估了超过60对NOT门控CAR电路。根据aCAR上的CD3ζ信号结构域，观察到不同的抑制剂量-反应特征。此外，表达LIR1-iCAR的T细胞显示出较少的耗竭表型。机制研究表明，SHP-1是LIR1-iCAR的主要细胞内调节因子，且iCAR以顺式方式发挥作用。在T细胞中开发的几个NOT门控电路被功能性地转移到原代自然杀伤（NK）细胞中。我们的NOT门控CAR电路为更安全、更有效的癌症免疫疗法提供了一种精确靶向策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何系统设计并优化NOT门控CAR电路，使其能特异性区分肿瘤细胞和健康细胞，并在T细胞和NK细胞中实现有效功能？
- 核心机制
- LIR1-iCAR通过SHP-1作为主要调节因子，以顺式方式抑制aCAR信号；CD3ζ(D23)变体对LIR1抑制更敏感，且LIR1-iCAR可减少T细胞耗竭。
- 主要证据
- 在T细胞中通过抗原板结合实验和杀伤实验筛选出最佳iCAR（LIR1）和aCAR（CD3ζ(D23)），并在NK细胞中验证；体内双肿瘤模型显示LIR1-iCAR能够保护OFF-Tumor细胞。
- 研究意义
- 该NOT门控CAR电路提供了一种精确靶向策略，有望提高癌症免疫疗法的安全性和有效性，并展示了从T细胞到NK细胞的跨细胞类型可移植性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
iCAR铰链域筛选
评估不同铰链域对LIR1 iCAR功能的影响，确定最佳铰链结构。
以LIR1为信号域，构建9种不同铰链域的iCAR，与28ζ aCAR共转导至T细胞，通过抗原板结合实验检测细胞因子分泌和激活标志物表达。
aCAR共刺激域和CD3ζ变体筛选
评估不同aCAR共刺激域和CD3ζ变体对NOT门控电路性能的影响，寻找最佳配对。
将LIR1 iCAR与不同共刺激域（1st、2nd、3rd代）和CD3ζ变体（28ζ、28ζ(D23)、28ζ(1XX)、CD3ε-28ζ）的aCAR配对，通过抗原板结合实验和细胞杀伤实验评估抑制效果和激活水平。
体外细胞毒性验证
验证NOT门控CAR T细胞对ON-Tumor和OFF-Tumor细胞的差异化杀伤能力。
将筛选出的CAR T细胞（28ζ aCAR + LIR1 iCAR 和28ζ(D23) aCAR + LIR1 iCAR）与ON-Tumor（Axl+）和OFF-Tumor（Axl+Her2+）Nalm6细胞共培养，检测靶细胞裂解率。
体内功能验证（T细胞）
在双肿瘤异种移植模型中验证NOT门控CAR T细胞是否能区分ON-Tumor和OFF-Tumor细胞。
将ON-Tumor（Antares+）和OFF-Tumor（F-Luc+）Nalm6细胞共同注射到NSG小鼠，随后注射CAR T细胞，通过生物发光成像分别监测两种肿瘤的负担。
T细胞耗竭评估
评估LIR1 iCAR是否减少CAR T细胞的耗竭表型。
对28ζ aCAR + LIR1 iCAR或Blank iCAR的T细胞进行连续刺激（两次），检测杀伤活性变化；并在转导后10天染色PD-1、TIM-3、LAG-3等耗竭标志物。
机制研究：SHP-1依赖性和顺式作用
确定LIR1 iCAR介导抑制是否依赖SHP-1，以及是顺式还是反式作用。
使用SHP-1或SHP-2敲除的Jurkat细胞，转导anti-ROR1 28ζ aCAR和LIR1 iCAR，进行抗原板结合实验检测CD69和IL-2；在三培养实验中，通过不同靶细胞组合评估顺式/反式作用。
NK细胞中iCAR筛选和验证
评估不同iCAR在NK细胞中的NOT门控功能，选择最佳候选进行体内验证。
将LIR1、LAIR1、CEACAM1、KIR3DL1和PD-1 iCAR与28ζ aCAR共转导至原代NK细胞，进行ON-Tumor和OFF-Tumor杀伤实验；对LIR1 iCAR进一步进行铰链域筛选（CD8WT、IgG4-b等）。
体内功能验证（NK细胞）
验证筛选出的NOT门控CAR NK细胞在单肿瘤和双肿瘤异种移植模型中的肿瘤区分能力。
在单肿瘤模型中，将ON-Tumor或OFF-Tumor Nalm6分别注射到不同小鼠组，然后注射CAR NK细胞，监测肿瘤负担；在双肿瘤模型中，将两种肿瘤共同注射，NK细胞治疗后分析外周血中肿瘤细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | X-VIVO 15培养基 | Lonza | 04-418Q |
| 人AB血清 | Valley Biomedical | HP1022 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 细胞因子补充 | 白细胞介素-2 | NCI BRB Preclinical Repository | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 病毒包装 | Freestyle 293表达培养基 | Fisher Scientific | 12-338-026 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 10-013 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 10437028 | |
| 青霉素/链霉素 | Corning | 30001CI | |
| L-谷氨酰胺 | Corning | 25005CI | |
| NK MACS培养基 | Miltenyi Biotech | 130-114-429 | |
| CTS NK-Xpander培养基 | ThermoFisher | A5019001 | |
| OptiPRO SFM培养基 | ThermoFisher | 12309-019 | |
| T细胞激活 | ImmunoCult™人CD3/CD28 T细胞激活剂 | STEMCELL | 10971 |
| 病毒转导 | RetroNectin®重组人纤连蛋白片段 | Takara Bio | T100B |
| 聚乙烯亚胺 | -- | -- | |
| FuGENE HD转染试剂 | Promega | E2312 | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Thermo Scientific | A1113803 |
| Zeocin | Thermo Scientific | R25005 | |
| 潮霉素B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| 抗原包被 | 人Her2/ErbB2蛋白 | Sino Biological | 10004-H08H |
| Axl激酶蛋白（胞外域，His标签） | Sino Biological | 10279-H08H | |
| 细胞毒性检测 | SYTOX™ Red死细胞染料 | Invitrogen | S34859 |
| 细胞因子检测 | 人IFNγ ELISA试剂盒 | BD Biosciences | 555142 |
| 人IL-2 ELISA试剂盒 | BD Biosciences | 555190 | |
| 人TNF-α ELISA试剂盒 | BD Biosciences | 555212 | |
| 流式分析 | APC-Cy7抗人CD69抗体 | BD Pharmingen | 557756 |
| Axl APC偶联抗体 | R&D Systems | FAB154A | |
| FITC抗人CD340 (erbB2/HER-2)抗体 | BioLegend | 324404 | |
| Myc-Tag (9B11)小鼠单克隆抗体（Alexa Fluor® 647偶联） | Cell Signaling Technology | 2233S | |
| V5标签单克隆抗体，FITC | ThermoFisher | R963-25 | |
| 抗CD3抗体 | BioLegend | 300322 / 300312 | |
| 抗CD56抗体 | BioLegend | 362511 / 362545 | |
| NK细胞培养 | OKT-3 | ThermoFisher | 14-0037-82 |
| 体内成像 | IVISbrite D-荧光素钾盐生物发光底物 | PerkinElmer | 122799 |
| D-荧光素 | Gold Biotechnology Inc | LUCK-5G | |
| 血液处理 | 红细胞裂解液 | Biolegend | 420302 |
| 细胞增殖检测 | CellTrace™ Violet细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C34557 |
| 基因递送 | PiggyBac转座子系统 | System Biosciences | -- |
| 细胞分离 | RosetteSep™人T细胞富集混合物 | STEMCELL Technologies | 15021 |
| NK细胞分离 | 人NK细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotech | 130-092-657 |
| 细胞渗透化 | 固定/透化溶液试剂盒 | BD Biosciences | 554715 |
| 流式分析 | GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 |
| GolgiStop | BD Biosciences | 554724 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iCAR信号域筛选 | iCAR的信号域（21种）及对应的跨膜域；aCAR为28ζ；T细胞来源；抗原包被浓度；检测指标（IFNγ、CD69、IL-2） 阅读提示：参见STAR★Methods下的'抗原板结合测定'和'CAR构建设计' |
| iCAR铰链域筛选 | LIR1 iCAR的铰链域（9种）；与aCAR共表达；检测指标 阅读提示：参见图1G-I及补充图2，以及STAR★Methods中的'抗原板结合测定' |
| aCAR共刺激域和CD3ζ变体筛选 | aCAR的共刺激域（CD28、4-1BB等）和CD3ζ变体（28ζ、28ζ(D23)等）；LIR1 iCAR；抗原剂量；E:T比 阅读提示：参见图2-3和补充图3-4，以及STAR★Methods中的'T细胞细胞毒性实验' |
| 体外细胞毒性验证 | 靶细胞（ON-Tumor/OFF-Tumor Nalm6）的构建和抗原表达；E:T比；共培养时间（24小时）；检测方法 阅读提示：参见图3E-H和STAR★Methods中的'T细胞细胞毒性实验' |
| 体内功能验证（T细胞） | NSG小鼠的品系和年龄；肿瘤细胞注射数量和途径；T细胞注射时间；生物发光成像底物和测量时间间隔 阅读提示：参见图4及STAR★Methods中的'异种移植小鼠模型' |
| T细胞耗竭评估 | 刺激次数和时间间隔；耗竭标志物（PD-1、TIM-3、LAG-3）染色时间；T细胞培养条件 阅读提示：参见图5A-B及STAR★Methods中的'T细胞培养'和'流式细胞术' |
| 机制研究：SHP-1依赖性和顺式作用 | Jurkat细胞系（WT、SHP-1 KO、SHP-2 KO）；CAR构建（anti-ROR1 aCAR）；抗原（ROR1、Her2）；共培养比例 阅读提示：参见图5C-G及STAR★Methods中的'细胞系生成和培养' |
| NK细胞中iCAR筛选和验证 | 原代NK细胞的来源和分离方法；iCAR构建（信号域和铰链域）；靶细胞；杀伤实验条件（E:T比、时间） 阅读提示：参见图6及STAR★Methods中的'初级NK细胞提取和培养'和'逆转录病毒生成和转导' |
| 体内功能验证（NK细胞） | 免疫缺陷小鼠的品系（NSG-TG(Hu-Il15)）；肿瘤细胞和NK细胞注射时间和数量；成像和血液分析方法 阅读提示：参见图7及STAR★Methods中的'CAR NK生成用于异种移植小鼠模型'和'异种移植小鼠模型用于CAR-NK' |