PD-L1胞质结构域质粒构建
构建表达PD-L1胞质结构域的重组质粒，以用于后续蛋白纯化和泛素化实验。
通过PCR扩增PD-L1 cDNA片段（氨基酸260-290），引入BamHI和NotI酶切位点，连接至pGEX4T-1载体，转化DH5α感受态细胞，测序验证。
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使用体外泛素化实验研究免疫检查点配体/受体泛素化生化细节的实验方案。
Protocol to investigate the biochemical details of immune checkpoint ligand/receptor ubiquitination using in vitro ubiquitination assay.
实验完整度
低本文为实验方案论文，虽包含逐步操作流程，但未提供完整实验结果数据，缺少功能验证和机制验证的实验结果。
主要模型
PD-L1胞质结构域重组蛋白 DC2.4细胞来源脂质体
重点核对
PD-L1胞质结构域（氨基酸260-290）的构建与纯化 CUL3/RBX1复合物在昆虫细胞中的表达与纯化及体外neddylation修饰 S427D-ARIH1和Y369E-WWP2等E3连接酶的制备 体外泛素化反应条件（如Ub、UBA1、UbcH7、底物浓度） 脂质体的制备及其对泛素化的影响
摘要
摘要：免疫检查点配体/受体（包括PD-L1和PD-1）的活性和稳定性受到泛素化的严格调控。在此，我们提出了一种检测各种E3连接酶对PD-L1胞质结构域泛素化作用，并评估磷酸化和膜结合对PD-L1泛素化影响的实验方案。我们描述了表达和纯化重组PD-L1胞质结构域及相关泛素化酶、从DC2.4细胞制备脂质体，以及使用体外泛素化实验检测PD-L1泛素化的步骤。关于此方案的完整使用和执行细节，请参见Xie等人。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 文献未明确说明研究问题，但根据摘要推断为如何检测免疫检查点配体/受体的泛素化及其调控因素。
- 核心机制
- 文献未明确说明核心机制，但描述了泛素化对PD-L1胞质结构域的修饰，以及磷酸化和膜关联对其影响。
- 主要证据
- 文献未提供实验结果，但方案预期可证明S427D-ARIH1能催化PD-L1胞质结构域的多聚泛素化，且脂质体抑制非磷酸化底物的泛素化而磷酸化底物受影响较小。
- 研究意义
- 文献明确指出该方案为评估其他免疫检查点配体和受体的泛素化提供了稳健的方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PD-L1胞质结构域重组蛋白表达与纯化
获得高纯度PD-L1胞质结构域蛋白，用于体外泛素化检测。
将质粒转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达，通过高压匀浆裂解，谷胱甘肽亲和纯化，TEV蛋白酶切除GST标签，再经尺寸排阻色谱纯化。
CUL3/RBX1复合物的表达与纯化
获得有活性的CUL3/RBX1复合物，用于后续neddylation修饰。
通过bacmid转染Sf9昆虫细胞，产生重组杆状病毒，感染Sf9细胞表达CUL3/RBX1，纯化得到蛋白复合物。
体外NEDDylation反应
对CUL3/RBX1复合物进行NEDD8修饰，生成N8~CUL3/RBX1，用于检测其E3连接酶活性。
根据表1配置反应混合物，加入NEDD8、UBA3、UBC12、CUL3/RBX1等，通过ATP启动反应，反应15分钟后加入EDTA终止，纯化N8~CUL3/RBX1。
S427D-ARIH1的表达与纯化
获得具有活性的S427D-ARIH1蛋白，用于体外泛素化实验。
将pET28-his-S427D-ARIH1质粒转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达，通过Ni-NTA亲和纯化和SEC纯化。
Y369E-WWP2的表达与纯化
获得具有活性的Y369E-WWP2蛋白，用于体外泛素化实验。
将pGEX6P-2-GST-Y369E-WWP2质粒转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达，通过谷胱甘肽亲和和SEC纯化。
DC2.4细胞脂质体制备
制备细胞来源的脂质体，用于评估膜结合对泛素化的影响。
收集DC2.4细胞，低渗处理、冻融裂解，离心收集膜组分，通过手动挤出器挤出均一的脂质体。
体外泛素化实验
检测PD-L1胞质结构域在不同E3连接酶作用下的泛素化，并评估磷酸化和膜关联的影响。
根据表2和表3配置反应混合物，加入Ub、UBA1、UbcH7、E3连接酶、底物（HA-PD-L1 CD），通过ATP启动反应，在不同时间点取样，Western blot检测泛素化水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | pGEX4T-1-HA-PD-L1 CD质粒 | -- | -- |
| 谷胱甘肽树脂 | Smart-Lifesciences | Cat#SA001025 | |
| Ni-NTA树脂 | Smart-Lifesciences | Cat#SA004025 | |
| 蛋白纯化 | Superdex 200 Increase 10/300 GL 凝胶过滤柱 | Cytiva | Cat#29148723 |
| 蛋白表达 | SIM SF表达培养基 | Sino Biological | Cat#MSF1 |
| 细胞转染 | LipoInsect转染试剂 | Beyotime | Cat#C0551 |
| 蛋白表达与纯化 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | Sangon Biotech | Cat#A100487 |
| 蛋白纯化 | 蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA） | MedChemExpress | Cat#HY-K0011 |
| 脂质体制备 | Avanti小型挤出器 | ANHEJIE | Cat#ANHEJIE-1 |
| 蛋白表达 | Sf9昆虫细胞 | Thermo Scientific | Cat#11496015 |
| 脂质体制备 | DC2.4细胞 | Sigma-Aldrich | Cat#SCC142M |
| 泛素化检测 | HRP偶联小鼠抗HA标签单克隆抗体 | ABclonal | Cat#AE025; RRID: AB_2769866 |
| 蛋白纯化 | CUL3抗体 | Cell Signaling Technology | Cat#2759; RRID: AB_2086432 |
| 蛋白表达与纯化 | 生物素标记的CD270-290肽段 | Gil Biochemistry | -- |
| 泛素化检测 | 磷酸化生物素标记的CD270-290肽段 | Gil Biochemistry | -- |
| 蛋白表达与纯化 | 硫酸卡那霉素 | Sangon Biotech | Cat#A506636 |
| 硫酸庆大霉素 | Sangon Biotech | Cat#A506614 | |
| 盐酸四环素 | Sangon Biotech | Cat#A600504 | |
| 琼脂 | Sangon Biotech | Cat#A505255 | |
| 琼脂糖 | Sangon Biotech | Cat#A620014 | |
| 蛋白纯化 | 咪唑 | Sangon Biotech | Cat#A500529 |
| 还原型谷胱甘肽 | Sangon Biotech | Cat#A600229 | |
| 蛋白表达与纯化 | 氯化钠 | Sangon Biotech | Cat#A610476 |
| 二硫苏糖醇 | Sangon Biotech | Cat#A620058 | |
| 蛋白纯化 | 甘油 | Sangon Biotech | Cat#A600232 |
| 蛋白分析 | 考马斯亮蓝R-250 | Sangon Biotech | Cat#A10037 |
| 蛋白纯化 | Triton X-100 | Sangon Biotech | Cat#A110694 |
| 蛋白分析 | RealBand预染蛋白marker | Sangon Biotech | Cat#C610210 |
| 细胞培养 | PBS缓冲液 | Sangon Biotech | Cat#E607008 |
| 蛋白表达 | X-Gal溶液 | Sangon Biotech | Cat#B541006 |
| 蛋白纯化 | 无水氯化镁 | Adamas-beta | Cat#829999A |
| 脂质体制备 | TM缓冲液 | Beyotime | Cat#ST455 |
| 蛋白分析 | 牛血清白蛋白 | Solarbio | Cat#PC0001 |
| 蛋白纯化 | 甘氨酸 | Solarbio | Cat#G8200 |
| 十二烷基硫酸钠 | Solarbio | Cat#S8010 | |
| 培养基配制 | 胰蛋白胨 | Thermo Scientific | Cat#LP0042B |
| 酵母提取物 | Thermo Scientific | Cat#LP0021B | |
| 分子克隆 | BamHI限制性内切酶 | NEB | Cat#R3136V |
| NotI限制性内切酶 | NEB | Cat#R3189V | |
| 2× PrimeSTAR Max DNA聚合酶 | Takara | Cat#R045A | |
| 蛋白分析 | 5× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 | Yeasen | Cat#20315ES05 |
| 蛋白纯化 | 重力流柱 | Cytiva | Cat#17043501 |
| 蛋白分析 | 分光光度计 | Thermo Scientific | NanoDrop Onec |
| 过滤 | 0.22 μm针头式过滤器 | Sangon Biotech | Cat#F513163 |
| 微生物培养 | 培养皿（60×15毫米） | Sangon Biotech | Cat#F611002 |
| 分子克隆 | ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | Cat#C112 |
| 微生物培养 | 摇床培养箱 | Shanghai Zhichen Instrument | Cat#ZWY-211B |
| 旋转摇床 | Zhejiang Lichen Technology | Cat#OM12112404 | |
| 离心 | 低温离心机 | Beckman Coulter | Cat#Allegra X-15R |
| 细胞裂解 | 超高压纳米匀浆机 | Shanghai Litu Ultra High Pressure Equipment | Cat#FB-110X15 |
| 蛋白加热 | 恒温金属浴 | JOANLAB Equipment | Cat#MDB100-C |
| 蛋白分析 | PAGE凝胶快速制备试剂盒（12.5%） | Yeasen | Cat#20326ES62 |
| DNA纯化 | HiPure凝胶纯化微量试剂盒 | Magen Biotechnology | Cat#D2110-02 |
| 质粒提取 | SuperPlasmid质粒小提试剂盒 | Jiangsu CoWin Biotech | Cat#CW2109 |
| bacmid提取 | 杆状病毒穿梭载体bacmid小提试剂盒 | YaJi Biological | Cat#D0031 |
| 蛋白浓缩 | 10 kDa Amicon超滤离心管 | Millipore | Cat#UFC9010 |
| 3 kDa Amicon超滤离心管 | Millipore | Cat#UFC9003 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PD-L1胞质结构域构建 | PCR引物序列、模板DNA浓度、PCR循环条件、限制性内切酶和连接反应条件 阅读提示：Step-by-step method details 步骤1-7，图3，表PCR反应和循环条件 |
| PD-L1胞质结构域蛋白纯化 | 表达菌株BL21(DE3)、IPTG浓度和诱导时间、高压匀浆压力、谷胱甘肽亲和纯化、TEV蛋白酶用量和消化时间、SEC条件 阅读提示：步骤8-28，图3 |
| CUL3/RBX1表达与纯化 | Sf9昆虫细胞培养密度、转染试剂和bacmid DNA量、病毒P1/P2扩增条件、感染时间和细胞密度、蛋白纯化步骤 阅读提示：步骤29-35，图4 |
| 体外NEDDylation | NEDD8、UBA3、UBC12、CUL3/RBX1浓度，ATP、DTT、EDTA浓度，反应时间和温度 阅读提示：步骤36-46，表1 |
| S427D-ARIH1和Y369E-WWP2表达纯化 | 表达菌株、IPTG浓度、诱导温度和时间、高压匀浆压力、亲和色谱和SEC条件 阅读提示：步骤47-75，图5 |
| 脂质体制备 | DC2.4细胞培养和收集方法、低渗处理时间、冻融循环、离心速度和时间、挤出次数和孔径 阅读提示：步骤84-85 |
| 体外泛素化实验 | Ub、UBA1、UbcH7、E3连接酶和底物浓度，ATP、DTT浓度，反应温度和取样时间，脂质体用量 阅读提示：步骤86-93，表2和表3，图6 |