构建AgRP神经元特异性Fto敲除/过表达小鼠模型
确定FTO在AgRP神经元中对体重的影响。
利用Agrp-Cre或Agrp-Ires-Cre小鼠与Ftotm1a(EUCOMM)Wtsi小鼠杂交获得Ftolox/lox/Agrp-Cre敲除小鼠，或通过注射AAV-hSyn-Flex-Fto-mCherry实现过表达，并观察体重、脂肪含量、进食量等表型。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
FTO通过改变AgRP神经元中Kif1a剪接和轴突囊泡运输促进体重增加
FTO promotes weight gain via altering Kif1a splicing and axonal vesicle trafficking in AgRP neurons.
实验完整度
高包含AgRP神经元特异性Fto敲除与过表达小鼠的体内表型分析、m6A-seq与异构体分析、体外KIF1A蛋白生化功能验证、原代神经元与PC12细胞功能实验等多层级证据
主要模型
AgRP神经元特异性Fto敲除小鼠 AgRP神经元特异性Fto过表达小鼠 小鼠ARC脑组织 原代海马神经元 PC12细胞
重点核对
Ftolox/lox/Agrp-Cre小鼠的构建及FTO敲除效率 AAV-hSyn-Flex-Fto-mCherry在Agrp-Ires-Cre小鼠ARC中的注射剂量与位点 Kif1a exon 13包含比例在不同进食条件下的变化 KIF1A体外ATPase活性与微管滑动速度 AgRP释放量在脑片高钾刺激下的测定
摘要
N6-甲基腺苷（m6A）是一种丰富的化学RNA修饰，参与许多生物过程的调控。m6A去甲基化酶FTO（脂肪量和肥胖相关蛋白）已知会影响体重，但其系统性背景和潜在机制仍不清楚。在这里，我们发现下丘脑中表达刺鼠相关肽（AgRP）的神经元中缺乏或过表达Fto的小鼠分别表现出体重降低和增加。FTO对AgRP神经元中与膜运输和可变剪接相关的蛋白质的mRNA上的m6A进行去甲基化。在下游，FTO调节的轴突运动蛋白Kif1a的可变剪接影响其铰链区，这与KIF1A的结构和功能相关。值得注意的是，AgRP神经元中的Kif1a敲低抑制了过表达Fto的小鼠的体重增加。此外，FTO增加了含有神经肽NPY和AgRP的致密核心囊泡从AgRP神经元中的运输和分泌。总的来说，这些结果揭示了大脑中一个新的调节性FTO-KIF1A轴，通过FTO对AgRP神经元表观转录组的调节，影响食欲刺激的AgRP神经元和全身能量稳态。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 下丘脑AgRP神经元中的FTO如何通过表观转录组调控影响体重?
- 核心机制
- FTO去除Kif1a pre-mRNA上的m6A甲基化，促进exon 13包含，改变KIF1A蛋白构象，增强其二聚化和微管依赖的ATPase活性，从而提高轴突运输速度，增加DCV运输和神经肽AgRP/NPY的释放，最终刺激食物摄入并减少能量消耗导致体重增加。
- 主要证据
- AgRP神经元特异性敲除Fto导致体重降低，过表达则体重增加；m6A-seq显示FTO对Kif1a等运输相关基因的m6A去甲基化；剪接分析发现Kif1a exon 13包含率改变；体外生化实验证明exon 13包含的KIF1A具有更高活性和运输速度；敲低Kif1a抑制FTO过表达引起的体重增加。
- 研究意义
- 揭示了大脑中FTO-KIF1A轴在调节食欲和能量稳态中的新机制，为理解肥胖的分子基础提供了新的视角，并可能为肥胖治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
m6A-seq分析FTO靶基因
鉴定AgRP神经元中FTO去甲基化的m6A修饰位点及靶基因。
提取Ftolox/lox和Ftolox/lox/Agrp-Cre小鼠ARC组织总RNA，进行m6A免疫沉淀后进行RNA-seq，比较两组m6A峰差异。
转录组异构体分析
检测FTO敲除对基因可变剪接的影响，特别是Kif1a和Cadps2。
对Ftolox/lox和Ftolox/lox/Tau-Cre小鼠下丘脑组织进行RNA-seq，使用RSEM和SplAdder分析异构体表达和剪接事件，计算PSI值。
体外KIF1A蛋白功能验证
验证Kif1a exon 13包含对KIF1A蛋白结构、二聚化、ATPase活性和运输速度的影响。
构建KIF1A-201（包含exon 13）和KIF1A-203（跳过exon 13）的His标签重组蛋白，进行尺寸排阻色谱和ATPase活性测定，并利用微管滑动实验测定驱动速度。
细胞水平功能验证
在细胞水平验证KIF1A异构体对轴突运输和神经肽分泌的影响。
在原代海马神经元中表达KIF1A-EGFP（exon 13包含或跳过），进行活细胞成像和Kymograph分析；在PC12细胞中稳定表达KIF1A异构体，检测NPY释放和囊泡分布。
体内生理相关性实验
验证FTO-KIF1A通路在生理条件下的重要性。
通过shHCR原位杂交检测Fto mRNA在不同进食状态下的表达；通过RT-PCR和数字PCR检测Kif1a exon 13包含比例；通过免疫组化检测DCV标记蛋白secretogranin II的密度；在AgRP神经元中敲低Kif1a并过表达Fto观察体重变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | Ftotm1a(EUCOMM)Wtsi小鼠 | International Mouse Resource Center IMSR, EMMA | RRID: IMSR_EM:05094 |
| Agrp-Cre小鼠 | -- | MGI:3688399 | |
| Agrp-Ires-Cre小鼠 | Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:012899 | |
| Sf1-Cre小鼠 | Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:012462 | |
| Sim1-Cre小鼠 | Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:006395 | |
| Pomc-Cre小鼠 | Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005965 | |
| Tau-Cre小鼠 | -- | NA | |
| NPY-hrGFP小鼠 | Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:006417 | |
| tdTomato (Ai14)小鼠 | Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:007908 | |
| Rosa26-LSL-Cas9敲入小鼠 | Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026175 | |
| FLP敲入小鼠 | Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:003946 | |
| 分子克隆 | 小鼠Fto cDNA | Sino Biological | MG53159-G |
| pAAV-hSyn-DIO-hM4D (Gi)-mCherry | Addgene | Cat #44362 | |
| pAAV-hSyn-DIO-mCherry | Addgene | Cat #50459 | |
| Western blot | 兔抗FTO抗体 | Proteintech | 27226-1-AP |
| 兔抗GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-25778 | |
| 兔抗KIF1A抗体 | Sigma-Aldrich | SAB2104191 | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Cayman Chemical | 10004301 | |
| m6A-seq | 兔抗m6A抗体 | Abcam | ab151230 |
| 正常兔IgG | Cell signaling technology | #2729 | |
| 免疫组化 | 兔抗secretogranin II抗体 | BIODESIGN | K55101R |
| 小鼠抗secretogranin II抗体 | Abcam | ab20245 | |
| 兔抗VGAT抗体 | GeneTex | GTX101908 | |
| 兔抗NPY抗体 | Immunostar | 22940 | |
| 小鼠抗NPY抗体 | Santa Cruz | sc-133080 | |
| 兔抗FTO抗体 | LifeSpan Biosciences | LS-B7788 | |
| 兔抗POMC抗体 | Phoenix Pharmaceuticals | H-029-30 | |
| 兔抗NUCB2抗体 | Sigma-Aldrich | N6789 | |
| 兔抗TH抗体 | Merck Millipore | AB152 | |
| 小鼠抗催产素抗体 | Merck Millipore | MAB5296 | |
| 豚鼠抗加压素抗体 | Peninsula Laboratories | T-5048 | |
| 兔抗CRH抗体 | Peninsula Laboratories | T-4037 | |
| 兔抗TRH抗体 | Santa Cruz | sc-366754 | |
| 兔抗c-Fos抗体 | Cell signaling technology | #2250 | |
| 兔抗DsRed抗体 | Takara Bio | 632496 | |
| 细胞培养 | 小鼠抗β-tubulin III抗体 | Sigma-Aldrich | T8578 |
| 免疫组化 | Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| Alexa Fluor 594驴抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗豚鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | |
| 驴抗小鼠Alexa Fluor 405 | Thermo Fisher Scientific | A31553 | |
| 绵羊抗DIG碱性磷酸酶抗体 | Roche | 1093274 | |
| 分析设备 | Illumina NextSeq 500 | Illumina | -- |
| AgRP释放检测 | 荧光AgRP EIA试剂盒 | Phoenix Pharmaceuticals | FEK-003-57 |
| NPY释放检测 | 小鼠神经肽Y EIA | RayBiotech Life | EIAM-NPY-1 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | Fto条件敲除小鼠的构建（Ftotm1a(EUCOMM)Wtsi与Cre品系杂交），AAV注射的滴度和位点 阅读提示：Methods: Generation of conditional Fto-KO mice, Generation of AgRP neuron-specific Fto-overexpressing mice |
| m6A-seq | ARC组织获取、RNA提取、抗体、测序平台、数据分析参数 阅读提示：Methods: m6A-seq |
| 剪接分析 | 下丘脑样本、RNA-seq流程、SplAdder参数、PSI值计算 阅读提示：Methods: Isoform expression analysis |
| 体外生化实验 | 重组KIF1A蛋白序列、纯化方法、ATPase活性测定条件、微管滑动实验条件 阅读提示：Methods: KIF1A ATPase activity test, Size-exclusion chromatography, Tubulin preparation and gliding assay |
| 细胞培养实验 | 原代神经元培养和转染效率，PC12细胞稳定转染和分化条件，NPY释放检测试剂盒 阅读提示：Methods: Hippocampal primary culture and live imaging, Analysis of Kif1a-expressing PC12 cells |