定量蛋白质组学分析
鉴定JB处理引起的蛋白质组变化，评估其对线粒体自噬的影响
MIA PaCa-2细胞经25 μM JB或DMSO处理24小时后，进行TMT标记定量蛋白质组学分析，筛选差异表达蛋白并进行富集分析。
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Jolkinolide B激活线粒体自噬以展现抗胰腺癌活性并减轻阿尔茨海默病认知缺陷
Jolkinolide B Activates Mitophagy to Exhibit Antipancreatic Cancer Activity and Alleviate Cognitive Deficits in Alzheimer's Disease.
实验完整度
高包含体外细胞实验、定量蛋白质组学、体内胰腺癌异种移植模型和5×FAD AD小鼠模型，并进行功能及机制验证。
主要模型
人胰腺癌细胞系MIA PaCa-2和BxPC-3 人正常胰腺上皮细胞HPDE6-C7 MIA PaCa-2异种移植小鼠模型 5×FAD阿尔茨海默病小鼠模型
重点核对
JB处理浓度和时间：体外实验使用25 μM JB处理24小时 体内给药方案：胰腺癌模型每日腹腔注射JB 20、40、60 mg/kg，持续28天 TOM40-Cys74共价结合验证：CETSA、HJB-Cy7竞争结合、5-IAF标记 5×FAD小鼠给药：60 mg/kg每日腹腔注射，持续2个月
摘要
线粒体自噬功能障碍导致受损线粒体的病理性积累，这与癌症和阿尔茨海默病等人类疾病的发生发展密切相关。发现更安全有效的线粒体自噬调节剂可能为治疗线粒体疾病提供新方法。共价结合药物因其高特异性、选择性和低耐药性而备受关注。在本研究中，我们证明天然环氧化合物Jolkinolide B (JB)在体内外均能特异性诱导线粒体自噬。质谱分析证实，JB直接结合线粒体外膜转位酶蛋白TOM40，导致胰腺癌细胞自噬性死亡。作为一种线粒体自噬增强剂，JB还能改善5×FAD阿尔茨海默病小鼠模型中的线粒体功能障碍并减轻认知缺陷。研究结果表明，JB选择性靶向线粒体以增强线粒体自噬，同时在胰腺癌和阿尔茨海默病小鼠模型中表现出极低的毒性，突显其作为线粒体疾病治疗剂的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 天然化合物JB是否通过调节线粒体自噬来抑制胰腺癌并改善阿尔茨海默病认知缺陷，其直接靶点是什么？
- 核心机制
- JB通过共价结合TOM40-Cys74，破坏TOM复合体对前体蛋白的转运，导致线粒体呼吸链复合物III和IV活性下降，ROS增加和线粒体膜电位丧失，从而激活线粒体自噬并诱导胰腺癌细胞自噬性死亡。
- 主要证据
- 通过TMT定量蛋白质组学、质谱鉴定、CETSA、HJB-Cy7竞争实验和C74S突变体实验，证实TOM40为直接靶标；体外细胞实验和异种移植小鼠模型显示JB诱导自噬性死亡并抑制肿瘤生长；5×FAD小鼠模型显示JB恢复线粒体自噬并改善认知行为。
- 研究意义
- JB作为一种特异性线粒体自噬调节剂，为胰腺癌和阿尔茨海默病等线粒体相关疾病提供了潜在治疗策略，其环氧结构可为共价药物设计提供新骨架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
线粒体自噬检测
验证JB对胰腺癌细胞自噬/线粒体自噬的诱导作用
利用MDC染色、Western blot检测LC3B-II、RAB7和OPTN水平，并通过透射电镜观察自噬体和自噬溶酶体。
细胞增殖抑制检测
评估JB对胰腺癌细胞增殖的影响及对正常细胞的毒性
通过CCK-8法和集落形成实验检测细胞活力及长期增殖能力，比较癌细胞和正常细胞的反应。
靶点鉴定
利用质谱直接鉴定JB的共价结合靶蛋白及结合位点
利用JB的环氧基团作为动态修饰进行蛋白质组学搜索，结合正向和反向策略筛选候选靶蛋白；随后通过CETSA、竞争结合实验和突变体验证确认TOM40-Cys74结合位点。
线粒体蛋白组学分析
探究JB对TOM40转运功能和线粒体蛋白质组的影响
分离高纯度线粒体，进行TMT标记定量蛋白质组学分析，并验证呼吸链复合物III和IV亚基的表达变化。
线粒体功能检测
评估JB对线粒体呼吸链活性、ROS产生和膜电位的影响
检测复合物III和IV活性，使用DCFH-DA探针检测ROS，JC-1探针检测线粒体膜电位。
体内胰腺癌模型验证
验证JB在体内的抗肿瘤效果和安全性
将MIA PaCa-2细胞皮下接种至裸鼠，待肿瘤体积达100 mm³后分组，每日腹腔注射JB（20、40、60 mg/kg）或溶剂，持续28天，测量肿瘤体积和体重，并通过H&E染色、肝功能指标评估毒性。
阿尔茨海默病模型验证
评估JB对5×FAD AD小鼠认知功能的影响
3月龄5×FAD AD小鼠每日腹腔注射JB（60 mg/kg）或溶剂，持续2个月，通过Morris水迷宫、Y迷宫、新物体识别和旷场实验评估认知功能，并用TEM观察海马线粒体形态。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞功能变化验证
分子表达变化验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | SH30243.01 |
| 胎牛血清 | GeminiBio | 900-108 | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | C11875500BT | |
| SMM 293-TⅡ培养基 | Sino Biological | M293TⅡ | |
| 青霉素-链霉素溶液 | HyClone | SV30010 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0043 |
| 集落形成实验 | 结晶紫溶液 | Beyotime | C0121 |
| 质谱样品制备 | 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | D5545 |
| 赖氨酰内切酶 | Wako | 125-05061 | |
| 胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| Empore C18柱 | CDS | 98-0604-0197-7 | |
| TMT标记 | Micro-BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23235 |
| 6标TMT试剂 | Thermo Fisher Scientific | 90068 | |
| HPLC分析 | UltiMate 3000高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Acclaim 120 C18色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | 074812 | |
| 质谱分析 | Nano EASY-nLC 1200液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 线粒体分离 | Percoll | Yeasen | 40501ES60 |
| Western blotting | PVDF膜 | Bio-Rad | 40501ES60 |
| ECL化学发光试剂盒 | Millipore | P90720 | |
| 复合物活性检测 | 复合物III活性检测试剂盒 | Solarbio | BC3240 |
| 复合物IV活性检测试剂盒 | Acmec | AC10216 | |
| ROS检测 | DCFH-DA探针 | Beyotime | S0033 |
| MMP检测 | JC-1探针 | Beyotime | C2003S |
| 蛋白纯化 | 抗FLAG G1亲和树脂 | Genscript | L00432-5 |
| FLAG肽 | GenScript | -- | |
| 10 kDa截留离心过滤器 | Millipore | UFC901008 | |
| 药物 | Jolkinolide B | Nanjing DASF Biotech Co, Ltd | 37905-08-1 |
| 17-羟基Jolkinolide B | Nanjing DASF Biotech Co, Ltd | 116360-82-8 | |
| 动物实验 | 蓖麻油 | MedChemExpress | HY-107799 |
| 药物分布检测 | AMG 510 | MedChemExpress | 2296729-00-3 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白质组学分析 | JB处理浓度和时间（25 μM，24小时）；细胞系为MIA PaCa-2；TMT标记和质谱参数 阅读提示：见Experimental Procedures中的'Sample Preparation for Mass Spectrometry'、'TMT Labeling'和'Data Analysis and Bioinformatics Analysis' |
| 线粒体自噬检测 | JB处理浓度和方法；阳性对照EBSS处理时间（4小时）；MDC染色条件 阅读提示：见'Quantification of Autophagy' |
| 靶点验证 | CETSA温度梯度；HJB-Cy7浓度（5 μM）和孵育时间；5-IAF浓度（1 μM）和孵育条件；突变体C74S 阅读提示：见'Cellular Thermal Shift Assay'和'Protein Purification and Gel-Based Imaging' |
| 体内胰腺癌模型 | 动物品系（BALB/c裸鼠，5周龄，雌性）；细胞接种量（5×10^6）；给药剂量（20、40、60 mg/kg，腹腔注射，每日，28天）；溶剂（15%蓖麻油） 阅读提示：见'Animal Experiments' |
| 阿尔茨海默病模型 | 5×FAD小鼠年龄（3月龄）；给药剂量（60 mg/kg，每日，2个月）；行为测试方法和时间点 阅读提示：见'Transgenic Mice and Behavioral Studies' |