抗体分离与鉴定
从精英中和者P27的PBMC中分离出具有中和活性的单克隆抗体FD22。
从P27的PBMC中分选记忆B细胞，培养13天后通过微量中和实验筛选出FD22。鉴定其基因来源和突变频率。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
来自中国HIV-1精英中和抗体的具有强ADCC活性的有效且广谱的CD4结合位点中和抗体
A potent and broad CD4 binding site neutralizing antibody with strong ADCC activity from a Chinese HIV-1 elite neutralizer.
实验完整度
高包含多层级证据：体外中和实验、细胞系结合与ADCC功能验证、AlphaFold3结构预测、突变验证及自体病毒逆转突变实验。
主要模型
U87 CD4+CCR5+细胞（中和实验靶细胞） ACH-2细胞（潜伏HIV激活模型） H9 (IIIB)细胞（HIV感染靶细胞） TZM-bl细胞（感染指示细胞）
重点核对
FD22重链来源于IGHV3-30胚系，SHM 37%，CDRH3长20个氨基酸 中和实验使用145株假病毒，U87 CD4+CCR5+细胞为靶细胞 ADCC实验以H9 (IIIB)为靶细胞，PBMC为效应细胞，E:T=6:1 FcγRIIIa刺激实验使用Jurkat-Lucia NFAT-CD16a报告细胞 AlphaFold3结构预测关键参数：ModelSeeds等
摘要
针对HIV-1包膜糖蛋白（Env）上保守表位的广谱中和抗体（bNAbs）的发现，因其在开发有效治疗和疫苗策略方面的潜力而受到广泛关注。在本研究中，我们从中国一名感染B支病毒23年的精英中和者体内分离并鉴定了一种CD4结合位点（CD4bs）抗体FD22。FD22的重链来源于罕见的IGHV3-30胚系基因，具有极高的体细胞高频突变（SHM）（37%），并包含一个独特的20个氨基酸长的CDRH3环。FD22表现出强效且广谱的中和活性，与著名的bNAb VRC01相当。它有效中和了145种不同HIV-1假病毒中的82%，包括中国两种主要流行株CRF01_AE和CRF07_BC。FD22与HIV-1感染细胞系强结合，有效结合FcγRIIIa受体，触发NK细胞脱颗粒并释放IFN-γ和β-趋化因子等关键细胞因子，并强力诱导针对HIV-1感染靶细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。通过AlphaFold3对FD22与HIV Env SOSIP三聚体的结构预测、位点突变和自体病毒逆转突变实验揭示，FD22的表位跨越关键CD4结合位点，包括Loop D、CD4结合环（CD4 BLP）和V5环。FD22独特的CDRH3长环通过其带负电的残基R102与CD4结合位点相互作用，这使其区别于其他CD4bs抗体。我们的发现为FD22在病毒中和和ADCC中的作用机制提供了有价值的见解。FD22的双重功能增强了其作为有前景的治疗性抗体的潜力，并为设计具有增强ADCC能力的CD4bs靶向疫苗提供了新途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 从中国HIV-1精英中和者中分离的CD4bs抗体FD22是否具有广谱中和活性及ADCC功能，并阐明其作用机制。
- 核心机制
- FD22通过其长的CDRH3环中的带正电荷残基R102与gp120上的CD4结合位点（Loop D、CD4 BLP、V5环）相互作用，介导中和和ADCC活性。
- 主要证据
- 中和实验显示FD22中和82%的145株假病毒，与VRC01相当；ADCC实验显示FD22诱导强效ADCC，优于VRC01和10-1074；AlphaFold3预测和突变分析证实R102的关键作用。
- 研究意义
- FD22作为治疗性抗体具有潜力，并为设计增强ADCC能力的CD4bs靶向疫苗提供新途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
结合活性与特异性分析
评估FD22与gp120的结合能力、亲和力及表位竞争性。
通过ELISA检测FD22与gp120蛋白的结合，BLI测定亲和力，竞争ELISA分析其与已知CD4bs抗体的竞争关系，并检测自体反应性。
中和活性评价
评估FD22对多种HIV-1假病毒的中和广度和效力。
使用145株Env假病毒进行中和实验，计算IC50，并比较FD22与VRC01的中和谱。
潜伏病毒激活抑制实验
评估FD22对激活后潜伏HIV感染靶细胞的抑制作用。
使用ACH-2细胞，以TNF-α或panobinostat激活潜伏HIV，然后加入FD22，检测其对靶细胞感染的抑制。
FcγRIIIa刺激与ADCC功能评估
评估FD22是否通过FcγRIIIa诱导ADCC效应。
使用Jurkat-Lucia NFAT-CD16a报告细胞检测FcγRIIIa刺激，NK细胞脱颗粒实验和LDH释放实验评估ADCC活性。
结构预测与关键残基验证
通过AlphaFold3预测FD22与Env SOSIP复合物结构，并通过突变验证关键残基。
使用AlphaFold3预测FD22 Fab与多种Env SOSIP三聚体的结构，分析相互作用界面；通过定点突变和自体病毒逆转突变验证R102等关键残基的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证中和活性
结构预测与突变验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Cytiva | -- | |
| Biomyc-3抗支原体试剂 | Biological Industries | -- | |
| SMM 293-TII培养基 | Sino Biological Inc. | -- | |
| 抗体生产 | 白细胞介素-2 | -- | -- |
| 白细胞介素-21 | -- | -- | |
| 3T3-msCD40L饲养细胞 | -- | -- | |
| 假病毒生成 | pNL4-3.Luc.R-E-质粒 | -- | -- |
| EZ Trans转染试剂 | Life-iLab | -- | |
| 中和实验 | 荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| 结合实验 | HRP标记的山羊抗人IgG抗体 | -- | -- |
| ABTS底物 | -- | -- | |
| 竞争ELISA | EZ-Link NHS-LC-生物素 | Thermo Fisher | -- |
| 10kDa离心过滤膜 | Millipore | -- | |
| BLI | Octet RED96系统 | ForteBio | -- |
| 细胞表面结合 | 活/死染料 | Thermo Fisher | -- |
| Alexa Fluor 647偶联的山羊抗人IgG (H+L)抗体 | Thermo Fisher | -- | |
| FcγRIIIa刺激 | Nano-Glo活细胞试剂 | Promega | N2058 |
| NK细胞激活 | NK细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-657 |
| 重组人IL-15 | Gibco | PHC9154 | |
| IMEM培养基 | Gibco | 12440053 | |
| 小鼠抗人CD107a-PE | BD Pharmingen | 555801 | |
| 小鼠抗人CD3-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 560835 | |
| 小鼠抗人CD56-PE-Cy™7 | BD Pharmingen | 557747 | |
| 小鼠抗人CD16-FITC | BD Pharmingen | 555406 | |
| 固定/通透化溶液试剂盒 | BD Biosciences | 554714 | |
| 小鼠抗人IFN-γ | BD Pharmingen | 564791 | |
| 小鼠抗人MIP-1β | BD Pharmingen | 560686 | |
| ADCC评估 | CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒 | Promega | G1780 |
| 裂解液 | Promega | G182A | |
| CytoTox 96试剂 | Promega | G179A | |
| 终止液 | Promega | G183A | |
| 自体反应性 | Alexa Fluor 647偶联的山羊抗人IgG (H+L) | Invitrogen | -- |
| 多反应性 | 心磷脂 | -- | -- |
| 单基因组扩增 | Platinum Taq高保真系统 | Invitrogen | -- |
| 基因克隆 | Primestar聚合酶 | TAKARA | -- |
| pcDNA3.1(-)表达载体 | Invitrogen Life Technologies | -- | |
| AXYGEN质粒小提试剂盒 | AXYGEN | -- | |
| 结构分析 | ChimeraX软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 中和实验 | 靶细胞U87 CD4+CCR5+的培养条件，假病毒的构建方法，抗体稀释倍数，孵育时间，检测系统 阅读提示：Materials and methods: Neutralization experiments |
| 潜伏病毒激活抑制实验 | ACH-2细胞的激活条件（TNF-α浓度，panobinostat浓度，处理时间），FD22浓度系列，TZM-bl细胞培养 阅读提示：Materials and methods: Inhibition of reactivated HIV-1 latently infected cells; P24 ELISA |
| FcγRIIIa刺激实验 | 靶细胞类型，抗体浓度，共培养时间，报告细胞系 阅读提示：Materials and methods: FcγRIIIa stimulation assay |
| NK细胞激活实验 | PBMC分离方法，NK细胞纯化试剂盒，IL-15浓度，E:T比例，孵育时间，抗体浓度 阅读提示：Materials and methods: NK cell activation |
| ADCC评估 | 靶细胞H9 (IIIB)，效应细胞PBMC，E:T比例，抗体浓度范围，孵育时间，LDH检测试剂盒 阅读提示：Materials and methods: ADCC evaluation |