表达与纯化复合物
获取稳定的100K-六邻体复合物用于结构研究。
在HEK293F细胞中共表达带Flag标签的ad3-hexon和带Strep标签的ad2-100K，通过Strep和Flag亲和层析纯化复合物。
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病毒编码的伴侣蛋白100K在腺病毒衣壳折叠和组装中的分子机制
Molecular mechanisms of the viral encoded chaperone 100K in capsid folding and assembly of adenovirus.
实验完整度
高包含体外共表达纯化、冷冻电镜结构解析、突变体功能验证（SEC、Western blot、负染）、ELISA等多层级证据，进行结构与功能验证。
主要模型
HEK293F细胞 腺病毒3型六邻体（ad3-hexon）与腺病毒2型100K（ad2-100K）共表达复合物
重点核对
100K二聚体与六邻体的三个接触位点（A、B、C）的相互作用 100K的钩状结构域和环285-310的功能 六邻体N端残基与100K二聚化界面凹槽的结合 100K的二聚化形式对伴侣功能至关重要
摘要
腺病毒是一种二十面体、无包膜的DNA病毒，可感染人类和其他动物。腺病毒的衣壳主要由主要衣壳蛋白六邻体（hexon）组装而成。六邻体的折叠和组装需要病毒编码的伴侣蛋白100K，其详细结构和伴侣机制尚不清楚。在此，我们报告了100K与未成熟六邻体三聚体复合物的冷冻电镜结构。结构显示，100K二聚体主要通过钩状结构域和从二聚化结构域伸出的环结合到未成熟六邻体的底部双果冻卷结构域。此外，在100K二聚化界面形成的凹槽容纳相邻六邻体原体的N端片段49-53。突变研究表明，果冻卷结构域和六邻体N端的相互作用对于六邻体的正确折叠和组装都是必需的。100K结合并稳定部分折叠的六邻体，防止六邻体过早聚集，促进六邻体顶部插入环的折叠，并促进六邻体三聚化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 腺病毒编码的伴侣蛋白100K如何通过其结构特征促进主要衣壳蛋白六邻体的折叠和组装？
- 核心机制
- 100K以同源二聚体形式结合未成熟六邻体的双果冻卷结构域，通过钩状结构域和环285-310稳定部分折叠的六邻体，阻止过早聚集，并促进顶部插入环折叠和三聚化。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构显示100K二聚体通过接触位点A、B、C与六邻体互作；功能验证表明敲除或突变这些位点显著影响六邻体正确组装。
- 研究意义
- 该研究揭示了100K作为病毒编码伴侣蛋白的独特结构和作用机制，为理解腺病毒衣壳组装提供了分子基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜结构解析
解析100K-六邻体复合物的原子结构。
通过GraFix稳定复合物，进行单颗粒冷冻电镜数据收集和图像处理，得到3.23 Å分辨率的复合物结构。
功能验证接触位点
证明接触位点A、B、C对100K伴侣功能的重要性。
构建100K和六邻体突变体，共表达后通过SEC分析六邻体的组装状态。
验证100K二聚化的重要性
确定100K二聚化对其伴侣功能是否必需。
构建二聚化界面突变体，通过SEC和GraFix分析寡聚态和功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 293-SIM培养基 | Sino Biological公司 | M293II |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | -- | -- |
| 蛋白纯化 | Strep-Tactin树脂 | IBA | 2-1201-010 |
| 抗Flag树脂 | GenScript | L00432 | |
| 脱硫生物素 | -- | -- | |
| 质谱分析 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| Thermo Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Fisher | -- | |
| Ultimate 3000高效液相色谱系统 | Thermo-Dionex | -- | |
| 冷冻电镜 | Titan Krios透射电子显微镜 | Thermo Fisher | -- |
| Gatan K3相机 | Gatan | -- | |
| Quantifoil载网 | Quantifoil | Cu | |
| Vitrobot Mark VI自动投入冷冻仪 | Thermo Fisher | -- | |
| Western blot | 抗Flag标签小鼠单克隆抗体 | CWBIO | CW0287M |
| 抗Strep标签II单克隆抗体 | Abbkine | A02230 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | CWBIO | CW0102S | |
| GAPDH小鼠单克隆抗体 | ABclonal | AC033 | |
| 抗腺病毒5型抗体 | Abcam | ab6982 | |
| VHH抗兔IgG | AlpalifeBio | L1904 | |
| ELISA | 96孔酶标板 | Corning | 9018 |
| 质谱分析 | pLink 2软件 | -- | -- |
| 结构预测 | AlphaFoldColab | -- | -- |
| 图像处理 | MotionCor2 | -- | -- |
| Gctf | -- | -- | |
| RELION 3.0 | -- | -- | |
| ResMap | -- | -- | |
| 模型构建 | COOT | -- | -- |
| 模型精修 | PHENIX | -- | -- |
| 图像可视化 | UCSF Chimera | -- | -- |
| UCSF ChimeraX | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | HEK293F细胞培养条件和转染比例，亲和层析步骤和缓冲液成分 阅读提示：Methods: Recombinant protein purification and sample preparation |
| 结构解析 | GraFix条件（甘油梯度浓度、戊二醛浓度、离心时间） 阅读提示：Methods: Recombinant protein purification and sample preparation |
| 功能验证 | 突变体构建、共表达、SEC分析条件 阅读提示：Methods: Functional verification of the contacts at sites A, B, and C |
| 二聚化验证 | 二聚化界面突变体、寡聚态分析（GraFix） 阅读提示：Methods: Mutagenesis studies of the dimeric 100K |