病毒繁殖与脂质谱分析
获得具有不同脂质组成的ZIKV病毒颗粒并验证其遗传和脂质差异。
在Vero和C6/36细胞中繁殖ZIKV,纯化后通过脂质组学分析包膜脂质组成;进行全基因组测序以确认遗传一致性。
Infectivity in full-term placenta of Zika viruses with different lipid profiles.
包含体外细胞系、人胎盘外植体、脂质组学、融合实验及遗传分析,涉及功能验证和机制验证。
Vero细胞系 C6/36细胞系 immortalized placental cell lines (HTR-8, BeWo, Sync-BeWo) human full-term placental explants
病毒在Vero和C6/36细胞中的繁殖条件(MOI 0.1和0.5,收获时间3和5天) 感染性测定采用FFA和MID,接种剂量范围2×10^5至2×10^1 FFU/50μl 融合实验使用R18标记,病毒蛋白与探针比例1:100 胎盘外植体感染使用10^5 FFU/0.5ml,PID50测定使用10倍稀释系列 qRT-PCR检测病毒载量,LoQ为10 GC/μl
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获得具有不同脂质组成的ZIKV病毒颗粒并验证其遗传和脂质差异。
在Vero和C6/36细胞中繁殖ZIKV,纯化后通过脂质组学分析包膜脂质组成;进行全基因组测序以确认遗传一致性。
比较FP-V和FP-C6在胎盘滋养层细胞系中的复制和感染性。
在HTR-8、BeWo和Sync-BeWo细胞中进行生长曲线和MID测定。
评估FP-V和FP-C6与胎盘细胞内体膜的融合能力。
使用R18亲脂性探针标记病毒,检测与细胞融合时的荧光变化。
比较不同细胞来源的ZIKV毒株在胎盘组织中的复制和感染性。
用人胎盘外植体感染三种ZIKV毒株的Vero和C6/36来源病毒,测定复制动力学和PID50。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Eagle最低必需培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Corning, Sigma-Aldrich | -- | |
| 非必需氨基酸 | MP Biomedicals | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| RPMI 1640培养基 | 无明确说明 | -- | |
| F12K Kaighn改良培养基 | 无明确说明 | -- | |
| 毛喉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| I型胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ELISA | β-hCG ELISA试剂盒 | IBL International | -- |
| 病毒感染 | 寨卡病毒株 | EVAg, BEI Resources | -- |
| 病毒滴定 | 抗黄病毒抗体4G2 | Millipore | MAB10216 |
| 过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Jackson Immuno Research Laboratories | -- | |
| True Blue底物 | KPL | -- | |
| 病毒纯化 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白质定量 | ELISA试剂盒 | Sino Biological Inc. | KIT40543 |
| 融合实验 | 十八烷基罗丹明B | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 脂质提取 | 甲醇 | 无明确说明 | -- |
| 氯仿 | 无明确说明 | -- | |
| 脂质组学 | Acquity超高效液相色谱系统 | Waters | -- |
| QToF Synapt XS HDMS质谱仪 | Waters MS Technologies | -- | |
| 测序 | QIAamp病毒RNA迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| SuperScript III一步法RT-PCR系统 | Invitrogen | -- | |
| Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| MiSeq试剂盒V3 | Illumina | -- | |
| 分子检测 | QIAsymphony DSP病毒/病原体中型试剂盒 | Qiagen | -- |
| QuantiTect探针RT-PCR试剂盒 | Qiagen | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Biorad | -- | |
| MEGAshortscript T7体外转录试剂盒 | Ambion | -- | |
| MEGAclear试剂盒 | Ambion | -- | |
| 免疫组化 | BenchMark ULTRA全自动免疫组化染色仪 | Ventana Medical Systems | -- |
| ULTRA CC2抗原修复液 | Roche | -- | |
| 抗β-hCG抗体 | Leica | -- | |
| ultraView通用DAB检测试剂盒 | Roche | -- | |
| 病毒培养 | 制霉菌素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 硫酸庆大霉素 | Euroclone | -- | |
| 脂质提取 | Pur-A-Lyzer透析管 | Sigma-Aldrich | -- |
| 病毒纯化 | Sorvall MTX 150微型超速离心机 | Thermo Scientific | -- |
| T-647.5定角转子 | Thermo Scientific | -- | |
| TH-641水平转子 | Thermo Scientific | -- | |
| 融合实验 | VICTOR Nivo多功能酶标仪 | PerkinElmer | HH35000500 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒繁殖 | Vero和C6/36细胞的培养条件、MOI(0.1和0.5)、吸附时间1小时、收获时间(3天和5天)、CPE观察标准 阅读提示:Methods 2.2 |
| 感染性测定 | FFA的细胞密度(135,000 cells/cm2)、病毒稀释系列、吸附1小时、48小时固定、抗体浓度(4G2 1:10,000) 阅读提示:Methods 2.2 |
| 生长曲线 | 细胞密度(135,000或140,000 cells/cm2)、MOI 1、吸附1小时、取样时间点(0,6,24,48,72 HPI) 阅读提示:Methods 2.6 |
| MID测定 | 细胞密度、5倍稀释系列(2×10^5至2×10^1 FFU/50μl)、吸附时间(5天或5,15,30分钟)、孵育5天 阅读提示:Methods 2.7 |
| 融合实验 | R18标记比例(1:100)、病毒量(5×10^4 FFU/ml)、4°C结合1小时、37°C监测12分钟 阅读提示:Methods 2.8 |
| 胎盘外植体感染 | 外植体大小(约30mm3)、感染剂量(10^5 FFU/0.5ml)、吸附12小时、上清收集时间(24,48,72 HPI) 阅读提示:Methods 2.10 |
| PID50测定 | 10倍稀释系列(1×10^5至1×10^1 FFU/0.5ml)、吸附12小时、72小时判定标准(病毒载量至少5倍升高) 阅读提示:Methods 2.10 |
| qRT-PCR | 引物和探针浓度(600nM引物,400nM探针)、模板体积(5μl)、循环条件、LoQ(10 GC/μl) 阅读提示:Methods 2.11 |