具有不同脂质谱的寨卡病毒在足月胎盘中的感染性

Infectivity in full-term placenta of Zika viruses with different lipid profiles.

作者信息Eva Mazzetto, Alessio Bortolami, Davide Bovo, Matteo Stocchero, Elisa Mazzacan, Alessandra Napolitan, Valentina Panzarin, Maria Rosa Tran, Gianpiero Zamperin, Adelaide Milani, Andrea Fortin, Michela Bigolaro, Paola Pirillo, Matteo Pagliari, Claudia Zanardello, Giuseppe Giordano, Maria Teresa Gervasi, Eugenio Baraldi, Calogero Terregino, Carlo Giaquinto, Francesco Bonfante
PMID39733819
期刊Virus Res
发布时间2025-02
DOI10.1016/j.virusres.2024.199518

实验完整度

包含体外细胞系、人胎盘外植体、脂质组学、融合实验及遗传分析,涉及功能验证和机制验证。

主要模型

Vero细胞系 C6/36细胞系 immortalized placental cell lines (HTR-8, BeWo, Sync-BeWo) human full-term placental explants

重点核对

病毒在Vero和C6/36细胞中的繁殖条件(MOI 0.1和0.5,收获时间3和5天) 感染性测定采用FFA和MID,接种剂量范围2×10^5至2×10^1 FFU/50μl 融合实验使用R18标记,病毒蛋白与探针比例1:100 胎盘外植体感染使用10^5 FFU/0.5ml,PID50测定使用10倍稀释系列 qRT-PCR检测病毒载量,LoQ为10 GC/μl

摘要

在黄病毒中,寨卡病毒(ZIKV)是唯一被正式认定为致畸原的虫媒病毒,因为它能够感染并穿过胎盘屏障,导致胎儿先天性畸形。虽然许多研究侧重于了解妊娠期间ZIKV的发病机制,但影响胎儿发育的病毒机制仍 largely unclear。在本研究中,我们使用具有不同脂质谱的病毒,调查了ZIKV在胎盘滋养层细胞中的毒力。首先,我们在哺乳动物或蚊虫细胞中繁殖了一种属于亚洲谱系的ZIKV毒株,获得两种病毒储存液,纯化并分析其遗传和脂质组成。随后,我们使用永生化细胞系和外植体评估了两种储存液在胎盘细胞中的感染性。我们发现两种病毒储存液显示一致的共有序列和均一的准种组成。然而,其包膜的脂质组成根据来源细胞显著不同,哺乳动物来源的病毒储存液相比来自蚊虫细胞的病毒颗粒,具有更高的磷脂酰胆碱含量。值得注意的是,源自哺乳动物细胞的ZIKV储存液在永生化绒毛滋养层细胞和人类足月胎盘外植体中显示出更高的感染性。这种增加的感染性与滋养层细胞脱壳阶段融合效率的增强相关,如使用亲脂性探针所证明。总的来说,我们的数据表明病毒脂质在足月胎盘中可能作为ZIKV感染性的决定因素,强调了脂质组学研究在病毒学中的重要性。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
病毒脂质组成是否影响ZIKV在足月胎盘中的感染性?
核心机制
哺乳动物细胞来源的ZIKV富含磷脂酰胆碱,增强病毒与胎盘绒毛滋养层细胞的内体融合效率,从而促进脱壳和病毒感染。
主要证据
永生化BeWo和Sync-BeWo细胞中,FP-V(Vero来源)的MID显著低于FP-C6(C6/36来源),融合实验显示FP-V融合更快;在胎盘外植体中,Vero来源病毒PID50更低,感染率更高。
研究意义
研究提示病毒脂质可能作为ZIKV感染性的决定因素,强调在实验设计时考虑病毒细胞来源的重要性。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

病毒繁殖与脂质谱分析

获得具有不同脂质组成的ZIKV病毒颗粒并验证其遗传和脂质差异。

在Vero和C6/36细胞中繁殖ZIKV,纯化后通过脂质组学分析包膜脂质组成;进行全基因组测序以确认遗传一致性。

2

永生化胎盘细胞系感染性评价

比较FP-V和FP-C6在胎盘滋养层细胞系中的复制和感染性。

在HTR-8、BeWo和Sync-BeWo细胞中进行生长曲线和MID测定。

3

融合效率分析

评估FP-V和FP-C6与胎盘细胞内体膜的融合能力。

使用R18亲脂性探针标记病毒,检测与细胞融合时的荧光变化。

4

人足月胎盘外植体感染

比较不同细胞来源的ZIKV毒株在胎盘组织中的复制和感染性。

用人胎盘外植体感染三种ZIKV毒株的Vero和C6/36来源病毒,测定复制动力学和PID50。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Eagle最低必需培养基Gibco--
胎牛血清Corning, Sigma-Aldrich--
非必需氨基酸MP Biomedicals--
L-谷氨酰胺Gibco--
青霉素/链霉素Gibco--
RPMI 1640培养基无明确说明--
F12K Kaighn改良培养基无明确说明--
毛喉素Sigma-Aldrich--
二甲基亚砜Sigma-Aldrich--
I型胶原蛋白Sigma-Aldrich--
β-hCG ELISA试剂盒IBL International--
寨卡病毒株EVAg, BEI Resources--
抗黄病毒抗体4G2MilliporeMAB10216
过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgGJackson Immuno Research Laboratories--
True Blue底物KPL--
Triton X-100Sigma-Aldrich--
ELISA试剂盒Sino Biological Inc.KIT40543
十八烷基罗丹明BThermo Fisher Scientific--
甲醇无明确说明--
氯仿无明确说明--
Acquity超高效液相色谱系统Waters--
QToF Synapt XS HDMS质谱仪Waters MS Technologies--
QIAamp病毒RNA迷你试剂盒Qiagen--
SuperScript III一步法RT-PCR系统Invitrogen--
Agencourt AMPure XP磁珠Beckman Coulter--
Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒Invitrogen--
Nextera XT DNA文库制备试剂盒Illumina--
MiSeq试剂盒V3Illumina--
QIAsymphony DSP病毒/病原体中型试剂盒Qiagen--
QuantiTect探针RT-PCR试剂盒Qiagen--
CFX96实时荧光定量PCR仪Biorad--
MEGAshortscript T7体外转录试剂盒Ambion--
MEGAclear试剂盒Ambion--
BenchMark ULTRA全自动免疫组化染色仪Ventana Medical Systems--
ULTRA CC2抗原修复液Roche--
抗β-hCG抗体Leica--
ultraView通用DAB检测试剂盒Roche--
制霉菌素Sigma-Aldrich--
硫酸庆大霉素Euroclone--
Pur-A-Lyzer透析管Sigma-Aldrich--
Sorvall MTX 150微型超速离心机Thermo Scientific--
T-647.5定角转子Thermo Scientific--
TH-641水平转子Thermo Scientific--
VICTOR Nivo多功能酶标仪PerkinElmerHH35000500

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
病毒繁殖
Vero和C6/36细胞的培养条件、MOI(0.1和0.5)、吸附时间1小时、收获时间(3天和5天)、CPE观察标准
阅读提示:Methods 2.2
感染性测定
FFA的细胞密度(135,000 cells/cm2)、病毒稀释系列、吸附1小时、48小时固定、抗体浓度(4G2 1:10,000)
阅读提示:Methods 2.2
生长曲线
细胞密度(135,000或140,000 cells/cm2)、MOI 1、吸附1小时、取样时间点(0,6,24,48,72 HPI)
阅读提示:Methods 2.6
MID测定
细胞密度、5倍稀释系列(2×10^5至2×10^1 FFU/50μl)、吸附时间(5天或5,15,30分钟)、孵育5天
阅读提示:Methods 2.7
融合实验
R18标记比例(1:100)、病毒量(5×10^4 FFU/ml)、4°C结合1小时、37°C监测12分钟
阅读提示:Methods 2.8
胎盘外植体感染
外植体大小(约30mm3)、感染剂量(10^5 FFU/0.5ml)、吸附12小时、上清收集时间(24,48,72 HPI)
阅读提示:Methods 2.10
PID50测定
10倍稀释系列(1×10^5至1×10^1 FFU/0.5ml)、吸附12小时、72小时判定标准(病毒载量至少5倍升高)
阅读提示:Methods 2.10
qRT-PCR
引物和探针浓度(600nM引物,400nM探针)、模板体积(5μl)、循环条件、LoQ(10 GC/μl)
阅读提示:Methods 2.11