验证CYLD对H. pylori诱导的经典NF-κB信号的影响
检测CYLD缺失是否影响H. pylori诱导的经典NF-κB信号。
使用CRISPR/Cas9生成CYLD敲除AGS和NCI-N87细胞，感染H. pylori P1或P12菌株，通过免疫印迹检测TAK1、IKKα/β、IκBα、RelA磷酸化及RelA核转位，并检测TNF和IL-8 mRNA表达。
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CYLD-TRAF6相互作用促进H. pylori感染中ADP-庚糖诱导的NF-κB信号传导
CYLD-TRAF6 interaction promotes ADP-heptose-induced NF-κB signaling in H. pylori infection.
实验完整度
高包含细胞系敲除/敲低、胃类器官模型、免疫共沉淀、体外蛋白结合和功能回复实验，验证了CYLD对TRAF6泛素化的调控机制。
主要模型
AGS细胞（CYLD敲除及对照） NCI-N87细胞（CYLD敲除及对照） 小鼠胃窦类器官（Cyld−/−及野生型）
重点核对
CYLD敲除对H. pylori诱导的经典NF-κB信号的影响（AGS和NCI-N87） CYLD与TRAF6的组成性相互作用（内源和体外重组蛋白） CYLD对TRAF6泛素化的影响（H. pylori感染30分钟时的TRAF6 IP） A20敲低对CYLD敲除细胞中NF-κB信号的影响
摘要
与幽门螺杆菌（H. pylori）感染相关的炎症反应引起胃微环境的多重改变，导致胃上皮屏障的缓慢而持续的破坏。H. pylori感染期间NF-κB的激活对该炎症反应至关重要。在这里，我们展示了CYLD与TRAF6组成性相互作用，增强H. pylori的ADP-庚糖诱导的胃上皮细胞经典NF-κB通路的激活。CYLD的这种激活作用与CYLD对受体介导的NF-κB活性的抑制作用形成对比。在机制上，CYLD以不依赖催化活性的方式抵消去泛素化酶A20对TRAF6泛素链的水解，从而在H. pylori感染早期支持TRAF6自身泛素化。此外，随后经典NF-κB依赖的A20从头合成提供负反馈回路，不仅关闭经典NF-κB通路，也关闭替代NF-κB通路。我们的发现强调了CYLD和A20在控制H. pylori感染中经典及替代NF-κB信号传导中的调控关系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CYLD在H. pylori感染中对NF-κB信号传导的作用及其机制是什么？
- 核心机制
- CYLD通过不依赖其去泛素化酶活性的方式与TRAF6组成性相互作用，抵消A20对TRAF6的去泛素化作用，从而稳定TRAF6自身泛素化，支持经典NF-κB激活；随后诱导的A20负反馈关闭经典和替代NF-κB通路。
- 主要证据
- 在CYLD敲除的AGS和NCI-N87细胞及Cyld−/−小鼠胃类器官中，H. pylori或ADP-庚糖诱导的经典NF-κB信号减弱；CYLD与TRAF6直接相互作用；CYLD缺失降低TRAF6泛素化，而A20敲低回复信号。
- 研究意义
- 揭示了CYLD在H. pylori感染中促进NF-κB激活的新角色，与受体介导的抑制功能相反，为理解H. pylori相关炎症和致病机制提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CYLD在胃类器官模型中的作用
在更接近体内的模型中验证CYLD对ADP-庚糖和IL-1β诱导NF-κB信号的影响。
从WT和Cyld−/−小鼠胃窦分离腺体并培养类器官，用ADP-庚糖或IL-1β处理，通过免疫印迹检测TAK1、IKKα/β、IκBα、RelA磷酸化。
验证CYLD与TRAF6的相互作用
检测CYLD是否与TRAF6相互作用，并确定相互作用区域。
通过免疫共沉淀检测内源CYLD-TRAF6相互作用，并在体外用重组人CYLD和TRAF6蛋白验证直接结合；构建CYLD截短突变体转染CYLDKO细胞，检测与FLAG-TRAF6的结合。
验证CYLD对TRAF6泛素化的影响
检测CYLD是否影响H. pylori感染诱导的TRAF6自身泛素化。
在WT和CYLDKO细胞中感染H. pylori，变性条件下进行TRAF6免疫沉淀，检测泛素化修饰；同时用TRAF6-Ubc13抑制剂C25-140和TRAF6 C70A突变体验证自身泛素化。
验证CYLD与A20的对抗作用
检测CYLD是否通过对抗A20的活性来稳定TRAF6泛素化并促进NF-κB信号。
在CYLDKO细胞中敲低A20，感染H. pylori，检测经典NF-κB信号（TAK1、IKKα/β、RelA磷酸化及RelA核转位）。
验证CYLD对替代NF-κB通路的影响
检测CYLD缺失是否影响H. pylori诱导的替代NF-κB通路。
在WT和CYLDKO细胞中感染H. pylori，检测NIK积累和p52核转位，并通过TRAF2免疫共沉淀检测A20与TRAF2复合物的相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco™ | 21875-034 |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| AGS细胞 | ATCC® | CRL-1739™ | |
| NCI-N87细胞 | ATCC® | CRL-5822™ | |
| 细菌培养 | 幽门螺杆菌P1菌株 | -- | -- |
| 幽门螺杆菌P12菌株 | -- | -- | |
| 类器官培养 | 基质胶 | Corning® | 354234 |
| 高级DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| B27补充剂 | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| N2补充剂 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| 人表皮生长因子 | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| Wnt替代-Fc融合蛋白 | ImmunoPrecise Antibodies Ltd | N001-0.1 mg | |
| 人Noggin蛋白 | Peprotech | 120-10C | |
| 人成纤维细胞生长因子-10 | Peprotech | 100-26 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| 人[Leu15]-胃泌素I | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| ROCK抑制剂(Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β受体I激酶抑制剂IV (Alk-I) | Calbiochem | 616454 | |
| 药物处理 | ADP-庚糖 | -- | -- |
| 重组人白细胞介素-1β | PeproTech | 200-01B-10UG | |
| LTα1β2 | -- | -- | |
| C25-140 | -- | -- | |
| 转染 | siLentFect™转染试剂 | Bio-Rad | 1703362 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco™ | 31985070 | |
| METAFECTENE® PRO转染试剂 | Biontex Laboratories | T040-5.0 | |
| 蛋白转染 | Lipofectamine® CRISPRMAX转染试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | CMAX00015 |
| Cas9 PLUS™试剂 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88803 |
| 免疫印迹 | PVDF膜 | Merck Millipore | -- |
| 化学发光HRP底物 | Merck Millipore | WBKLS0500 | |
| 化学发光HRP底物（用于GAPDH） | Cytiva | RPN2209 | |
| RT-qPCR | NucleoSpin® RNA Plus试剂盒 | Macherey-Nagel | 740984.250 |
| RevertAid™第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| SensiMix™ SYBR® Hi-ROX试剂盒 | Meridian Bioscience | QT605-05 | |
| StepOnePlus™实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| 重组蛋白 | 重组人A20蛋白 | BPS Bioscience | 80408 |
| 重组人CYLD蛋白 | OriGene | SKUTP319629 | |
| 重组人TIFA蛋白 | Novus Biologicals | NBP1-99103-50ug | |
| 重组人TRAF6蛋白 | US Biological | 375664 | |
| 质粒构建 | BamHI-HF限制性内切酶 | New England Biolabs GmbH | R3136S |
| NheI-HF限制性内切酶 | New England Biolabs GmbH | R3131S | |
| T4连接酶 | New England Biolabs GmbH | M0202 | |
| Q5®定点突变试剂盒 | New England Biolabs GmbH | E0554S | |
| QuikChange XL定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | 200516 | |
| NucleoSpin凝胶和PCR纯化试剂盒 | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| CRISPR/Cas9 | Alt-R® CRISPRCas9引导RNA | IDT | Hs.Cas9.CYLD.1.AA |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（AGS、NCI-N87）、培养条件（RPMI-1640+10% FCS）、血清饥饿（0.2% FCS 16-20h）、细胞密度（AGS 6x10^5/60mm，NCI-N87 1x10^6/60mm） 阅读提示：Methods: Cell lines and culture conditions |
| 细菌感染 | H. pylori菌株（P1或P12）、MOI=100、感染时间（15-150分钟）、细菌培养条件（微需氧，10%马血清+10 μg/ml万古霉素） 阅读提示：Methods: Bacterial culture |
| 药物处理 | ADP-庚糖浓度（200 nM或500 nM）、IL-1β浓度（10 ng/ml）、处理时间 阅读提示：Figure legends (Fig. 1F-G, EV1I) and Methods |
| 基因敲除 | CYLD敲除方法（CRISPR/Cas9 guide RNA序列）、对照细胞（未成功敲除的细胞）、克隆数（两个克隆） 阅读提示：Methods: Generation of CYLD-depleted cell lines |
| siRNA敲低 | siRNA序列（A20si_5, A20si_9, CYLDsi_E1, CYLDsi_UTR等）、浓度（A20 40 nM, CYLD 40 nM, cIAP1 25 nM, TAK1 20 nM）、处理时间（48小时） 阅读提示：Methods: Transfection of siRNAs |
| 免疫沉淀 | 细胞裂解缓冲液（含1% SDS用于变性条件）、抗体（抗TRAF6、抗TIFA）、蛋白量（2 mg）、磁珠（Protein A/G） 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation |
| 免疫印迹 | 抗体稀释比例、封闭条件（5% milk或BSA）、PVDF膜、化学发光底物 阅读提示：Methods: SDS-PAGE and immunoblotting; Reagents and tools table |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、引物（TNF, IL-8, RPL13）、内参基因（RPL13）、数据标准化方法（ΔΔCT） 阅读提示：Methods: Quantitative PCR |