chIRAP基因发现与序列分析
鉴定一个在chIFITM2基序内的新开放阅读框，并分析其序列特征和进化保守性。
通过序列比较发现486 bp的ORF，进行结构预测、启动子分析、不同禽类序列比对，并通过PCR检测细胞和组织中的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一种新型鸡源性干扰素相关抗病毒蛋白的鉴定及其靶向PRDX1的抗病毒机制研究
Identification and antiviral mechanism of a novel chicken-derived interferon-related antiviral protein targeting PRDX1.
实验完整度
高包含体外细胞实验（DF-1等）、鸡胚体内实验、Co-IP、质谱分析、分子对接、点突变及功能验证等多层级证据。
主要模型
DF-1细胞系 鸡胚 CEK、CEF原代细胞
重点核对
chIRAP过表达对VSV-EGFP、NDV-rL-EGFP、NDV-Na-EGFP感染的抑制作用（MOI和时间） siRNA敲低内源性chIRAP对病毒增殖的影响 鸡胚中chIRAP转染（5 μg DNA/0.8 μl jetPEI）后H1N1感染（1×10^5 Pfu） chIRAP与PRDX1的相互作用（Co-IP）及分子对接预测位点 PRDX1点突变（D79A等）对chIRAP抗病毒效果和ROS水平的影响
摘要
在本研究中，我们通过序列分析和比较鉴定了一种新的鸡特异性蛋白，命名为鸡干扰素相关抗病毒蛋白（chIRAP），它在体外抑制包括甲型流感病毒（IAV）和新城疫病毒（NDV）在内的多种病毒的增殖，并且高表达chIRAP的鸡胚减少了IAV感染。对chIRAP相互作用蛋白的质谱分析以及影响chIRAP功能的相互作用蛋白的筛选显示，内源性鸡过氧化物还原酶1（chPRDX1）的缺失显著降低了chIRAP的抗病毒效果。为了阐明chPRDX1影响chIRAP抗病毒效果的功能位点，我们基于分子对接结果构建了chPRDX1的点突变体（D79A、T90A、K93A、Q94A、R110A、R123A），并通过敲低内源性chPRDX1结合过表达突变体策略筛选影响chIRAP抗病毒效果的位点，结果显示这些位点的突变在不同程度上影响了chIRAP的抗病毒效果，其中D79A最为显著，且chPRDX1的D79A突变降低了chPRDX1调节活性氧（ROS）的能力。chIRAP可能通过调节chPRDX1的D79位点的细胞内ROS平衡来发挥抗病毒作用。总之，我们鉴定了一种新的鸡源性抗病毒蛋白，阐明了其抗病毒效果并初步探索了其作用机制，为禽源性病毒性疾病尤其是禽源性相关人畜共患病的防治提供了新的工具和选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鉴定新型鸡源性抗病毒蛋白并探究其抗病毒作用及机制。
- 核心机制
- chIRAP通过PRDX1的D79位点调节细胞内ROS平衡来发挥抗病毒作用。
- 主要证据
- chIRAP在体外抑制多种病毒，鸡胚实验减少IAV感染；Co-IP和分子对接显示与PRDX1相互作用；D79A突变显著影响抗病毒效果并降低ROS清除能力。
- 研究意义
- 为禽源性病毒病和人畜共患病的防治提供新工具和思路，为其他物种抗病毒药物开发提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
病毒感染和干扰素刺激对chIRAP表达的影响
检测chIRAP是否响应病毒和干扰素刺激，并受干扰素通路调控。
qRT-PCR检测NDV感染和I/II/III型干扰素刺激后chIRAP表达水平，以及过表达chIRAP对干扰素通路相关基因的影响。
chIRAP体外抗病毒效果分析
验证chIRAP过表达对多种病毒的抑制作用。
构建chIRAP重组表达质粒转染DF-1细胞，通过CCK8、激光共聚焦、荧光观察、流式细胞术和WB检测对VSV、NDV、H9N2的抑制效果。
内源性chIRAP敲低对病毒感染的影响
探究内源性chIRAP缺失对病毒增殖及干扰素抗病毒效应的影响。
通过siRNA敲低chIRAP，检测敲低效率、细胞活力、病毒增殖情况，以及chIFNλ3的抗病毒效应是否受影响。
鸡胚中chIRAP的抗病毒效果验证
验证chIRAP在体内的抗病毒作用。
通过鸡胚卵黄囊动脉注射chIRAP质粒，48小时后感染H1N1，检测病毒载量和chIRAP表达。
chIRAP诱导型细胞系的构建与表征
建立稳定表达chIRAP的细胞系以研究其抗病毒机制。
构建pLV-TRE3G-chIRAP-HA载体，与pLV-Tet3G共转染DF-1细胞，筛选单克隆，优化诱导条件，验证抗病毒活性。
chIRAP相互作用蛋白的鉴定与功能筛选
筛选与chIRAP相互作用并影响其抗病毒功能的蛋白。
通过Co-IP和质谱鉴定相互作用蛋白，siRNA敲低候选蛋白检测对chIRAP抗病毒效果的影响，并用Co-IP验证与PRDX1的相互作用。
PRDX1点突变对chIRAP抗病毒效果和ROS水平的影响
确定PRDX1上影响chIRAP功能的位点，并探究机制。
构建PRDX1点突变体，敲低内源性PRDX1后过表达突变体，检测对chIRAP抗病毒效果的影响；检测突变体对ROS清除能力以及chIRAP对ROS水平的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白质检测与分析
细胞功能检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Cytiva | -- | |
| 蛋白检测 | HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| GFP标签抗体 | Proteintech | -- | |
| 流感病毒HA抗体 | SinoBiological | -- | |
| PRDX1抗体 | Abmart | -- | |
| β-actin抗体 | Genetex | -- | |
| α-tubulin抗体 | Genetex | -- | |
| GAPDH抗体 | Genetex | -- | |
| HRP标记二抗 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 质粒构建与转染 | pcDNA3.1载体 | Invitrogen | -- |
| 蛋白裂解 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Sangon Biotech | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green实时荧光定量PCR预混液 | Roche | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 鸡胚实验 | in vivo-jetPEI转染试剂 | Polyplus-transfection | -- |
| 免疫共沉淀 | IP裂解液 | Beyotime | -- |
| ROS检测 | 二氢罗丹明123 | MCE | -- |
| 免疫共沉淀 | 磁珠 | -- | -- |
| 细胞实验 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 观察 | EVOS M5000显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 流式细胞术 | CytoFLEX流式细胞仪 | BECKMAN COULTER | -- |
| 蛋白免疫印迹 | PVDF膜 | GE Healthcare | -- |
| GEGENOME XRQ增强化学发光试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | DF-1细胞培养条件：DMEM+10%FBS+1%青霉素/链霉素，37°C，5% CO2 阅读提示：见Materials and methods, Cell lines |
| 病毒扩增与滴度测定 | 病毒株（NDV-Na-EGFP、NDV-rL-EGFP、H9N2、VSV-EGFP）及其MOI，TCID50测定方法 阅读提示：见Materials and methods, Viruses |
| chIRAP过表达 | 转染试剂和质粒剂量（如2 μg），转染时间48小时 阅读提示：见Materials and methods, Plasmids construction and transfection |
| siRNA敲低 | siRNA浓度50 nM，转染试剂Lipofectamine RNAiMAX，处理时间48小时 阅读提示：见Materials and methods, siRNA silencing |
| 鸡胚实验 | 鸡胚日龄（15日），注射剂量（5 μg DNA/0.8 μl jetPEI），感染病毒量（1×10^5 Pfu），处理时间 阅读提示：见Materials and methods, Chicken embryo challenge test |
| 病毒吸附与进入 | 吸附温度4°C，时间1小时；进入温度37°C，时间1小时 阅读提示：见Materials and methods, Virus adsorption assay, Virus entry assay |
| ROS检测 | 探针（Dihydrorhodamine 123），浓度、孵育时间（30分钟），检测方法（流式） 阅读提示：见Materials and methods, Detection of intracellular ROS levels |