验证IFNγ对TKI敏感性的作用
检测IFNγ是否增强TKI对HCC细胞的杀伤作用。
使用重组IFNγ预处理HCC细胞（SNU-182、Hep3B等），随后给予索拉非尼、瑞戈非尼或乐伐替尼处理，通过细胞活力、细胞死亡和LDH释放检测评估效果。
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IFNγ通过减轻蛋白未折叠应激促进GSDME介导的肝细胞癌焦亡，增强TKI疗效
IFNγ augments TKI efficacy by alleviating protein unfolding stress to promote GSDME-mediated pyroptosis in hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高涵盖体外细胞系、体内小鼠模型、患者数据及临床样本等多个层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
HCC细胞系（SNU-182、Hep3B、SNU-387、Hepa1-6、Hep-55.1C） 小鼠皮下移植瘤模型（C57BL/6） HCC患者队列（STORM试验及TMA样本）
重点核对
HCC细胞系中IFNγ（10 ng/mL）预处理24小时 TKI处理浓度：索拉非尼（8-20 μM）、瑞戈非尼（15-20 μM）、乐伐替尼（10 μM） PERK抑制剂GSK2606414（1 μM体外，50 mg/kg体内） GSDME表达状态 PD-1抗体（100 μg/只）给药
摘要
酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）是晚期肝细胞癌（HCC）的标准治疗方法。然而，其疗效常常受到耐药性的限制，主要源于肿瘤内在机制。在本研究中，我们证明肿瘤微环境中的IFNγ可以增强TKI反应，且HCC细胞上IFNγ受体的缺失导致体内TKI耐药。机制上，IFNγ与TKI协同诱导HCC细胞发生GSDME介导的焦亡。PERK介导的未折叠蛋白反应（UPR）保护HCC细胞免受TKI诱导的焦亡。IFNγ通过诱导PDIA1的表达减弱PERK的激活，从而减轻蛋白未折叠应激。在体内，抑制PERK增强TKI治疗，且PERK高表达与HCC患者较差的总生存期相关。此外，产生IFNγ的CD8+ T细胞可以增强TKI疗效。将PD-1阻断以激活T细胞反应与TKI治疗联合，可协同抑制表达GSDME的HCC肿瘤的生长，且PERK抑制剂可进一步增强该效果。我们的发现揭示了IFNγ信号如何调节TKI反应，并展示了ICB介导的免疫治疗与TKI治疗序贯联合用于GSDME阳性HCC患者的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究IFNγ信号是否以及如何调节HCC对TKI治疗的反应性。
- 核心机制
- IFNγ通过JAK-STAT1通路诱导PDIA1表达，减轻蛋白未折叠应激，抑制PERK介导的UPR，从而增强TKI诱导的caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡。
- 主要证据
- 在多种HCC细胞系中，IFNγ预处理增强TKI诱导的细胞死亡和GSDME裂解；IFNGR1缺失导致体内TKI耐药；体内PERK抑制增强TKI疗效；GSDME过表达增加肿瘤对TKI的敏感性；临床样本中PERK高表达与不良预后相关。
- 研究意义
- 研究揭示了IFNγ信号在调节TKI反应中的作用，并为GSDME阳性HCC患者提供了一种潜在的ICB联合TKI（并联合PERK抑制剂）的序贯治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定细胞死亡模式
确定IFNγ和TKI诱导的细胞死亡是否为焦亡。
使用铁死亡抑制剂（Fer-1）、坏死性凋亡抑制剂（Nec-1）和泛caspase抑制剂（zVAD-fmk、IDN-6556）处理，观察LDH释放；并通过形态学观察和免疫印迹检测caspase-3和GSDME裂解。
评估GSDME表达对TKI敏感性的影响
验证GSDME表达是否增强体内TKI抗肿瘤效果。
在低GSDME表达的小鼠HCC细胞（Hep-55.1C和Hepa1-6）中异位表达GSDME-Flag，接种至C57BL/6小鼠，给予索拉非尼处理，监测肿瘤生长和免疫细胞浸润。
解析UPR在TKI诱导焦亡中的作用
确定UPR是否保护HCC细胞免受TKI诱导的焦亡，并鉴定关键分支。
使用UPR抑制剂（4-PBA）或各分支抑制剂（4μ8C、GSK2606414、PF429242）处理，检测细胞死亡、caspase-3和GSDME裂解；并分析PERK通路蛋白（p-PERK, p-eIF2α, ATF4, CHOP等）表达。
验证IFNγ对PERK通路的抑制
探索IFNγ增强TKI诱导焦亡的机制是否涉及PERK通路抑制。
检测IFNγ预处理对索拉非尼诱导的PERK磷酸化及下游蛋白表达的影响；并通过STAT1敲除、PDIA1敲低或过表达进一步验证分子机制。
评估联合治疗策略
评估PD-1阻断联合TKI及PERK抑制剂在体内的抗肿瘤效果。
在GSDME表达的Hep-55.1C肿瘤模型中，给予抗PD-1抗体、索拉非尼和/或GSK2606414治疗，监测肿瘤生长和生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Procell | -- |
| MEM培养基 | Procell | -- | |
| DMEM培养基 | Procell | -- | |
| 胎牛血清 | Cegrogen Biotech | -- | |
| 药物处理 | 索拉非尼 | MedChemExpress | -- |
| 4-苯基丁酸 | MedChemExpress | -- | |
| GSK2606414 | MedChemExpress | -- | |
| 4μ8C | MedChemExpress | -- | |
| PF429242 | MedChemExpress | -- | |
| ISRIB | MedChemExpress | -- | |
| 铁抑素-1 | MedChemExpress | -- | |
| 巴瑞替尼 | MedChemExpress | -- | |
| 瑞戈非尼 | APExBIO | -- | |
| 乐伐替尼 | APExBIO | -- | |
| 坏死抑素-1 | Cayman Chemical | -- | |
| Z-VAD-FMK | Cayman Chemical | -- | |
| 恩瑞卡生 | Selleck Chemical | -- | |
| 流式分析 | BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞因子处理 | 重组人IFNγ | R&D | -- |
| 重组小鼠IFNγ | R&D | -- | |
| 细胞死亡检测 | 细胞毒性LDH检测试剂盒 | Dojindo | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 7-AAD | -- | -- | |
| 流式分析 | Zombie NIR染料 | BioLegend | -- |
| 固定/透化溶液 | BioLegend | 420801 | |
| 透化/洗涤缓冲液 | BioLegend | 421002 | |
| 抗CD45抗体 | BioLegend | 30-F11, | |
| 抗CD3抗体 | BioLegend | 145-2C11, | |
| 抗CD4抗体 | BioLegend | GK1.5, | |
| 抗CD8抗体 | BioLegend | 53-6.7, | |
| 抗IFNγ抗体 | BioLegend | XMG1.2, | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MedChemExpress | HY-K0010 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | MedChemExpress | HY-K0022, | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗PARP抗体 | CST | 9542 | |
| 抗裂解PARP抗体 | CST | 5625 | |
| 抗GSDME抗体 | Abcam | ab215191 | |
| 抗caspase-3抗体 | Santa Cruz | sc-56053 | |
| 抗XBP1S抗体 | ABclonal | A22546 | |
| 抗磷酸化PERK抗体 | Invitrogen | MA5-15033 | |
| 抗PERK抗体 | Proteintech | 20582-1-AP | |
| 抗eIF2α抗体 | CST | 5324 | |
| 抗磷酸化eIF2α抗体 | Abcam | ab32157 | |
| 抗ATF4抗体 | Santa Cruz | sc-390063 | |
| 抗CHOP抗体 | CST | 5554 | |
| 抗GADD34抗体 | Proteintech | 10449-1-AP | |
| 抗PDIA1抗体 | Proteintech | 11245-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-1g | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz | sc-47778 | |
| qPCR | RNAiso Plus | TaKaRa | 9108 |
| PrimeScript RT预混液 | TaKaRa | RR036A | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| 基因编辑 | lentiCRISPR v2载体 | Addgene | 52961 |
| pLKO.1载体 | Addgene | 10878 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 基因克隆 | ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | C112 |
| T细胞共培养 | OVA257-264肽 | GenScript | RP10611CN |
| 重组小鼠IL-2 | Sino Biological | 51061-nmae | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M3148 | |
| EasySep人CD8+ T细胞富集试剂盒 | StemCell Technologies | 19053 | |
| CFSE | -- | -- | |
| 流式分析 | 流式细胞仪 | BD | FACSVerse |
| 未折叠蛋白检测 | PROTEOSTAT聚集体检测试剂盒 | Enzo | ENZ-51035-0025 |
| RNA测序 | NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Agilent Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina HiSeq 2000 | Illumina | -- | |
| 免疫组化 | EDTA抗原修复液 | -- | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 动物实验 | 抗PD-1抗体 | BioXCell | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和处理 | 细胞系来源、培养基组成、IFNγ处理时间和浓度（10 ng/mL，24小时）、TKI种类和剂量（索拉非尼8-20 μM、瑞戈非尼15-20 μM、乐伐替尼10 μM） 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture; 图1和图2图注 |
| 基因编辑 | sgRNA序列、shRNA序列、敲除或敲低效率验证、筛选时间 阅读提示：Materials and Methods: Generation of knockout and knockdown cells |
| 体内肿瘤模型 | 细胞接种数量（5×10^6）、小鼠品系（C57BL/6）、给药方案（索拉非尼10-20 mg/kg、GSK2606414 50 mg/kg、抗PD-1 100 μg）、分组和样本量 阅读提示：Materials and Methods: Animal experiments; 图4、图6图注 |
| 细胞死亡检测 | LDH释放实验的试剂盒、细胞铺板密度、处理时间 阅读提示：Materials and Methods: LDH release assay |
| UPR分析 | qPCR引物、PROTEOSTAT检测步骤、抑制剂浓度（4-PBA 1 mM, GSK2606414 1 μM） 阅读提示：Materials and Methods: Quantitative PCR analysis, Unfolded protein load assay |
| 蛋白免疫印迹 | 抗体列表及稀释比、裂解液成分、电泳条件 阅读提示：Materials and Methods: Immunoblotting |