全基因组CRISPR筛选
鉴定SFTSV感染必需的关键宿主因子。
使用CRISPR敲除文库（Mouse-GeCKOv2 Library B）感染MEFs，经过两轮SFTSV感染，富集存活细胞，测序分析鉴定候选基因。
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全基因组CRISPR筛选鉴定LRP1为SFTSV的进入因子
Genome-wide CRISPR screening identifies LRP1 as an entry factor for SFTSV.
实验完整度
高包含CRISPR筛选、细胞感染实验、结合内化实验、蛋白相互作用（co-IP、SPR）、体外中和实验及小鼠模型验证，证据层级丰富。
主要模型
小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） HEK293T细胞 Vero E6细胞 致死性SFTSV小鼠模型（C57BL/6J）
重点核对
MEFs中LRP1敲除或敲低显著抑制SFTSV感染 LRP1中和抗体在30μg/mL浓度下有效阻断病毒进入 LRP1-CLII-Fc蛋白竞争性抑制SFTSV感染（IC50=1.339 μg/mL） 小鼠模型中抗LRP1抗体降低死亡率（从56.7%降至16%）
摘要
严重发热伴血小板减少综合征（SFTS）是一种由SFTS病毒（SFTSV）引起的新兴蜱传疾病，具有高死亡率，对公共卫生构成重大威胁。为了确定针对SFTSV的潜在治疗靶点，我们进行了全基因组敲除筛选，该筛选鉴定了先前已知的宿主因子CCR2，并揭示前低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）作为SFTSV的进入因子。在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，敲低或敲除LRP1显著减弱SFTSV感染。此外，抑制LRP1可抑制MEFs中SFTSV假病毒感染，表明其在病毒进入中的作用。通过免疫共沉淀（co-IP）和表面等离子体共振（SPR）揭示了SFTSV糖蛋白Gn与LRP1通过CLI和CLII结构域的相互作用。此外，LRP1拮抗剂和中和抗体能有效减弱MEFs中的SFTSV感染。在致死性雄性小鼠模型中施用LRP1中和抗体可减少病毒载量，减轻组织损伤，并提高存活率。本研究将LRP1鉴定为SFTSV的宿主进入受体，为治疗策略的开发提供了靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鉴定SFTSV感染所必需的宿主因子，并评估其作为治疗靶点的潜力。
- 核心机制
- LRP1作为SFTSV的进入受体，其CLI和CLII结构域直接与病毒糖蛋白Gn结合，介导病毒进入宿主细胞。
- 主要证据
- CRISPR筛选、敲除和敲低实验证明LRP1对SFTSV感染至关重要；结合和内化实验证实其进入作用；co-IP和SPR显示Gn与LRP1的直接结合；中和抗体在体内外有效抑制感染。
- 研究意义
- LRP1作为SFTSV的进入受体，为开发针对SFTS的治疗策略提供了有希望的靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证LRP1对SFTSV感染的影响
确认LRP1在SFTSV感染中的作用。
通过RNAi敲低和CRISPR/Cas9敲除LRP1，检测病毒RNA、蛋白水平和病毒滴度。
评估LRP1在病毒进入中的作用
确定LRP1是否介导SFTSV进入细胞。
使用SFTSV假病毒、中和抗体阻断时间点实验、结合和内化实验研究病毒进入。
鉴定LRP1与SFTSV糖蛋白的相互作用
阐明LRP1与病毒蛋白的直接结合机制。
通过共免疫沉淀和SPR验证Gn与LRP1的结合域，并测试重组蛋白对感染的抑制。
评估LRP1靶向治疗在体内外的效果
验证靶向LRP1是否能抑制SFTSV感染和减轻疾病。
使用LRP1中和抗体和LRPAP预处理MEFs，随后进行小鼠实验，评估生存率、病毒载量和组织病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR筛选 | 小鼠GeCKOv2文库B | Addgene | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| RNA干扰 | 靶向Lrp1的小干扰RNA | GenePharma | -- |
| RNA提取与RT-qPCR | RNAiso Easy试剂 | Takara | -- |
| RT-qPCR | Evo M-MLV逆转录预混液 | Accurate Biotechnology | AG11706 |
| SYBR Green预混液Pro Taq HS | Accurate Biotechnology | AG11701 | |
| Western blotting | RIPA裂解缓冲液 | Biosharp | -- |
| 抗LRP1抗体 | CST | 64099 | |
| 抗Strep标签抗体 | Abbkine | ABT2230 | |
| 抗HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 免疫染色 | DAPI染色液 | -- | -- |
| 抗SFTSV NP抗体 | 自备 | -- | |
| 抗PDPN抗体 | Invitrogen | MA5-16113 | |
| 山羊抗小鼠IgG-FITC二抗 | Invitrogen | F-2761 | |
| 山羊抗兔IgG 594二抗 | Bioss | BB07081455 | |
| 山羊抗叙利亚仓鼠IgG 488二抗 | Invitrogen | A78958 | |
| CRISPR敲除 | lenti-CRISPRv2质粒 | Addgene | 52961 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 病毒滴定 | 山羊抗小鼠IgG-FITC二抗 | Invitrogen | F-2761 |
| 中和试验 | 抗LRP1抗体 | Invitrogen | MA1-27198 |
| LRP1-CLII-Fc重组蛋白 | RD | 2368-L2 | |
| LRPAP蛋白 | Sino Biological | 50281-M08H | |
| 免疫共沉淀 | Strep-Tactin琼脂糖树脂 | Iba | 2-1201-010 |
| 抗HA纳米抗体琼脂糖珠 | AlpaLifeBio | KTSM1305 | |
| 蛋白表达与纯化 | pET-30a(+)载体 | -- | -- |
| Ni-NTA琼脂糖树脂 | Sangon | C600791 | |
| Amicon离心过滤器 | Amicon | 30 | |
| SPR | Biacore T200系统 | GE Healthcare | -- |
| CM5芯片 | -- | -- | |
| LRP1 CLIII-Fc重组蛋白 | RD | 4824-L3 | |
| LRP1 CLIV-Fc重组蛋白 | RD | 5395-L4 | |
| 人IgG1 Fc片段 | RD | 110-HG-100 | |
| 小鼠实验 | 抗LRP1抗体 | Invitrogen | MA1-27198 |
| 阴性对照IgG | Proteintech | 66002-1-Ig | |
| 免疫组化 | 内源性过氧化物酶阻断剂 | Beyotime | P0100B |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | MEFs表达Cas9，感染MOI=1，两轮感染策略 阅读提示：注意Fig. 1a和Methods中“Genome-wide knockout screening”部分 |
| LRP1敲除 | 两个sgRNA删除外显子1和2，puromycin筛选浓度2 μg/mL 阅读提示：注意Fig. 2a和Methods中“CRISPR/Cas9 knockout”部分 |
| 结合和内化实验 | MOI=10，4°C结合1小时，内化37°C 3小时 阅读提示：注意Fig. 3c-e和Methods中“SFTSV binding and internalization assays”部分 |
| 中和试验 | 抗LRP1抗体浓度范围，LRPAP浓度范围，预处理4小时 阅读提示：注意Supplementary Fig. 5a-f和Methods中“Neutralization assays”部分 |
| 小鼠实验 | 丝裂霉素C预处理剂量0.03 mg/小鼠，感染剂量105 TCID50，抗体剂量30 μg/小鼠 阅读提示：注意Fig. 5a和Methods中“Mouse experiments”部分 |