活体蝙蝠感染模型建立
评估JFB对EBOV和MARV感染的临床结果、病毒复制和排毒情况。
通过口服、鼻内和皮下联合接种EBOV-Mayinga或MARV-Ozolin，监测体温、体重、血液学、排毒及组织病毒载量。
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牙买加果蝠对埃博拉病毒而非马尔堡病毒的易感性由内在差异驱动
Jamaican fruit bats' competence for Ebola but not Marburg virus is driven by intrinsic differences.
实验完整度
高包含活体蝙蝠感染模型、体外细胞感染、病毒进入与复制实验、先天免疫信号通路分析及转录组测序等多层级验证。
主要模型
牙买加果蝠（Artibeus jamaicensis） JFB原代肾细胞（AjKi_RML1、AjKi_RML2） JFB原代肺细胞（AjLu_RML3） JFB翼膜成纤维细胞（AjUFi_RML6）
重点核对
EBOV-Mayinga和MARV-Ozolin的接种剂量（总3.0×10^4 TCID50）及接种途径（口服、鼻内、皮下） 体内实验的观察时间点（3、7、28 DPI）及各时间点的动物数量（n=4） RT-qPCR检测病毒RNA的检测限（组织2.2 log10 copies/g，拭子1.63 log10 copies/mL） 体外感染实验的MOI（0.1或1.5）和检测时间点（24、48、72、96、120 HPI） IFN-I信号抑制实验中使用的抑制剂及浓度（itacitinib 0.25–25 nM，BAY-985 25 nM）
摘要
埃博拉病毒（EBOV）和马尔堡病毒（MARV）是引起人类出血热的人畜共患丝状病毒。相关性数据提示蝙蝠是EBOV的自然宿主，但在任何蝙蝠样本中均未发现EBOV的全长基因组或分离株。在此，我们通过口服、鼻内和皮下联合接种EBOV或MARV，在牙买加果蝠（JFB，Artibeus jamaicensis）中模拟丝状病毒感染。EBOV感染导致全身性病毒复制和感染性病毒的经口排出。MARV复制是短暂的，且不排毒。在体外，JFB细胞复制EBOV的效率高于MARV，且MARV感染诱导先天抗病毒反应，而EBOV能有效抑制该反应。使用表达EBOV或MARV糖蛋白的VSV假颗粒或复制型VSV进行的实验表明，EBOV在JFB细胞中早期进入和复制具有优势。总体而言，本研究描述了丝状病毒在JFB及其细胞中的物种特异性表型。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 牙买加果蝠对不同丝状病毒（埃博拉病毒与马尔堡病毒）的易感性差异及其背后的病毒-宿主相互作用机制是什么？
- 核心机制
- EBOV在JFB细胞中进入和复制效率高于MARV，且EBOV能有效抑制I型干扰素（IFN-I）信号通路，而MARV不能有效拮抗，导致MARV复制受限。
- 主要证据
- 活体蝙蝠感染实验显示EBOV播散性感染并经口排毒，而MARV复制短暂；体外实验显示MARV在JFB细胞中诱导IFN-I反应而EBOV不诱导；VSV假颗粒和重组VSV实验证实EBOV进入和早期复制优势。
- 研究意义
- 该JFB-EBOV模型可用于研究影响病毒感染动力学和传播的生理及环境应激因素，有助于理解丝状病毒与蝙蝠宿主间的互补性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
病毒复制与排毒动态分析
比较EBOV和MARV在JFB体内的复制能力和排毒模式。
通过RT-qPCR和病毒滴定检测拭子、组织和血清中的病毒RNA及感染性病毒。
免疫应答评估
评估EBOV和MARV感染后JFB的先天免疫和体液免疫反应。
通过RT-qPCR检测ISG和细胞因子mRNA表达，ELISA检测GP特异性抗体，病毒中和试验检测中和抗体，流式细胞术分析淋巴细胞亚群。
体外细胞感染实验
比较EBOV和MARV在JFB细胞中的复制效率、进入效率和IFN-I信号拮抗能力。
使用多种JFB细胞系（原代和永生化）感染不同EBOV和MARV毒株，监测复制动力学和宿主基因表达；使用VSV假颗粒和重组VSV评估进入和早期复制差异；通过western blot检测STAT1/2磷酸化。
IFN-I信号通路功能验证
验证MARV因无法有效拮抗IFN-I信号而复制受限。
使用IFN-I信号抑制剂（BAY-985、itacitinib）处理细胞，评估对EBOV和MARV复制的影响；检测外源IFN-β对病毒复制和ISG表达的敏感性。
转录组分析
比较EBOV和MARV感染后JFB肝脏的转录组变化。
对3 DPI肝脏RNA进行mRNA测序，分析差异表达基因和通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒滴定 | Vero E6细胞 | ATCC | CRL-1586 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| RNA提取 | RNeasy小型试剂盒 | Qiagen | -- |
| QIAamp病毒RNA试剂盒 | Qiagen | -- | |
| RT-qPCR | TaqMan快速病毒一步法预混液 | Applied Biosystems | -- |
| QuantStudio 6或3 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | pSTAT1抗体（Y701） | Cell Signaling Technology | 9167S |
| pSTAT2抗体（Y690） | Cell Signaling Technology | 88410S | |
| 总STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 14994S | |
| 总STAT2抗体 | Cell Signaling Technology | 72604S | |
| EBOV VP24抗体 | Sino Biological | 40454-T46 | |
| EBOV VP40抗体 | GeneTex | GTX134034 | |
| MARV VP40抗体 | The Native Antigen Company | MAV12450-100 | |
| RIG-I抗体 | Kerafast | 1C3 | |
| β-微管蛋白抗体 | Sigma Aldrich | T8328 | |
| Lamin A/C抗体 | Cell Signaling Technology | 4777S | |
| Clarity Western ECL底物 | BioRad | -- | |
| SuperSignal West Femto底物 | Thermo Scientific | -- | |
| iBright成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | TrypLE Express消化液 | Gibco | -- |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| IFN-β表达 | pcDNA3.4载体 | GenScript | -- |
| FreeStyle 293表达培养基 | Gibco | -- | |
| PEI MAX转染试剂 | Polysciences | 24765-1 | |
| IFN-β纯化 | HisPur Ni-NTA树脂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| Ni-NTA Superflow柱 | Qiagen | -- | |
| HiTrap Capto Q阴离子交换柱 | Cytiva | -- | |
| AKTA FPLC系统 | GE Healthcare | -- | |
| IFN-I抑制实验 | BAY-985抑制剂 | -- | -- |
| 伊他替尼 | -- | -- | |
| 高分子量聚肌胞苷酸 | Invitrogen | -- | |
| 病毒中和试验 | EBOV GP ELISA抗原 | -- | -- |
| MARV GP ELISA抗原 | IBT Bioservices | 0506-015 | |
| ELISA | Maxisorp板 | Nunc | -- |
| TMB底物试剂盒 | SeraCare | 5120-0047 | |
| 流式细胞术 | Alexa Fluor蛋白标记试剂盒 | Invitrogen | A10238 |
| ViaKrome 808可固定活力染料 | Beckman Coulter | -- | |
| Cytofix/Cytoperm试剂盒 | BD Biosciences | -- | |
| 别藻蓝蛋白标记抗CD79a抗体 | BD Biosciences | HM57 | |
| 异硫氰酸荧光素标记抗CD3ε抗体 | BioRad | CD3-12 | |
| Cytoflex LX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| BCR测序 | NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7103S |
| NEBNext多重寡核苷酸（Illumina） | New England Biolabs | E7335S | |
| MiSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| 血液学 | ProCyte DX血液分析仪 | IDEXX Laboratories | -- |
| 血液生化 | VetScan VS2生化分析仪 | Abaxis | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 活体感染 | EBOV-Mayinga和MARV-Ozolin病毒株、接种总剂量3.0×10^4 TCID50、接种途径（口服、鼻内、皮下）、动物年龄和性别比例 阅读提示：Methods: Bat inoculation |
| 样本采集与检测 | 拭子采集时间点（感染前、每2天至14 DPI、21 DPI、尸检）、组织采集时间点（3、7、28 DPI）、RT-qPCR检测限、病毒滴定检测限 阅读提示：Methods: Bat inoculation, RNA extractions and RT-qPCR, Virus titration |
| 体外感染 | 细胞系（AjKi_RML1、AjKi_RML2、AjUFi_RML6等）、MOI（0.1或1.5）、感染时间、培养基成分、重复次数 阅读提示：Methods: In vitro infections |
| IFN-I信号分析 | 抑制剂（BAY-985、itacitinib）浓度、IFN-β浓度和处理时间、western blot抗体信息 阅读提示：Methods: IFN-I pathway inhibition, Western blot analysis |
| 转录组分析 | RNA样本质量、测序平台（NextSeq）、差异表达分析参数（padj<0.05, fold change>2） 阅读提示：Methods: Next-generation sequencing of mRNA |