构建重组腺病毒疫苗
构建表达WNV prM-E和CHIKV E3-E2-6K-E1抗原的二价重组腺病毒Ad5-WNV-CHIKV。
将密码子优化的WNV prM-E和CHIKV E3-E2-6K-E1基因用2A肽连接，克隆至pVRC载体，再亚克隆至pKAd5CMV-NSrfh载体，转染293细胞拯救病毒。
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针对西尼罗病毒和基孔肯雅病毒的新型二价重组腺病毒载体疫苗单次给药在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答
Humoral and cellular immune response to a single dose of a novel bivalent recombinant adenovirus-vector vaccine against West Nile virus and chikungunya virus in mice.
实验完整度
高包含体外抗原表达验证（IFA、WB）、小鼠体液免疫（ELISA、中和试验）和细胞免疫（ELISpot、ICS）等多个独立证据层级，并进行了功能验证。
主要模型
HEK293细胞 HEK293T细胞 Vero细胞 C57BL/6小鼠
重点核对
免疫剂量：低剂量2×10^8 vp/只，高剂量1×10^9 vp/只 免疫途径：单次肌内注射，50 μL 免疫时间：2周 对照组：Ad5-GFP（1×10^9 vp/只） 中和试验方法：WNV假病毒中和试验和CHIKV蚀斑减少中和试验
摘要
背景：西尼罗病毒（WNV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）是由蚊子传播的人畜共患病原体，在全球范围内造成显著的发病率和死亡率。目前，尚无针对WNV和CHIKV的人用疫苗。方法：本研究开发了一种新型二价重组人腺病毒5型（Ad5）疫苗，命名为Ad5-WNV-CHIKV，其编码WNV prM-E和CHIKV E3-E2-6K-E1抗原。通过蛋白质印迹和免疫荧光试验验证了WNV和CHIKV目标抗原的表达。随后，我们评估了C57BL/6小鼠单次肌内注射Ad5-WNV-CHIKV后的体液和细胞免疫应答。结果：低剂量（每只小鼠2×10^8病毒颗粒[vp]）和高剂量（每只小鼠1×10^9 vp）的Ad5-WNV-CHIKV均诱导了针对病毒靶标的强烈免疫应答，产生了针对WNV-E、CHIKV E1和CHIKV E2蛋白的特异性免疫球蛋白G，并以剂量依赖性方式产生了针对WNV和CHIKV的中和抗体。此外，该疫苗诱导了强大的细胞免疫，其特征在于多功能抗原反应性CD4+和CD8+ T细胞群，如ELISpot和细胞内细胞因子染色试验所确定。结论：单次剂量的二价Ad5-WNV-CHIKV疫苗在小鼠中诱导了针对WNV和CHIKV的强效中和抗体和细胞免疫应答。这些发现为开发针对WNV和CHIKV的疫苗奠定了基础。单剂疫苗可能预防这两种疾病。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过单次免疫二价重组腺病毒载体疫苗同时诱导针对西尼罗病毒和基孔肯雅病毒的保护性免疫应答？
- 核心机制
- 疫苗通过表达WNV prM-E和CHIKV E3-E2-6K-E1抗原，诱导特异性IgG抗体和多功能CD4+/CD8+ T细胞反应，且偏向Th1型免疫应答。
- 主要证据
- 在小鼠中，ELISA检测到针对WNV-E、CHIKV E1和E2的IgG抗体；中和试验显示针对WNV和CHIKV的中和抗体；ELISpot和ICS显示IFN-γ、IL-2、TNF-α分泌增加。
- 研究意义
- 提供了开发针对WNV和CHIKV的疫苗的基础，有望实现一苗防两病，并为其他二价腺病毒载体疫苗的开发提供参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证抗原表达
验证Ad5-WNV-CHIKV在细胞中表达目标抗原。
感染HEK293细胞后，通过IFA和WB检测WNV和CHIKV抗原的表达。
免疫小鼠
评估单次肌内注射Ad5-WNV-CHIKV在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答。
将C57BL/6小鼠随机分为三组，分别注射Ad5-GFP（对照）、低剂量Ad5-WNV-CHIKV（2×10^8 vp/只）和高剂量Ad5-WNV-CHIKV（1×10^9 vp/只），2周后采集血清和脾细胞。
体液免疫应答检测
检测免疫小鼠血清中特异性IgG抗体和中和抗体。
使用ELISA检测针对WNV-E-DIII、CHIKV E1和E2蛋白的特异性IgG抗体滴度；使用假病毒中和试验检测抗WNV中和抗体，使用蚀斑减少中和试验检测抗CHIKV中和抗体。
细胞免疫应答检测
检测免疫小鼠脾细胞中抗原特异性T细胞反应。
使用ELISpot定量IFN-γ分泌细胞；使用细胞内细胞因子染色（ICS）评估CD4+和CD8+ T细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4和TNF-α的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | pVRC载体 | -- | -- |
| pKAd5CMV-NSrfh载体 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Vazyme | -- | |
| 间接免疫荧光试验 | 4%组织细胞固定液 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- |
| 山羊血清 | Beijing Solarbio | -- | |
| 兔抗CHIKV E2单克隆抗体 | Alpha Diagnostic International, Inc. | -- | |
| 小鼠抗WNV-E单克隆抗体 | Sino Biological | 40345-MM15-100 | |
| FITC标记的山羊抗兔IgG | ZSGB Biotech | ZF0311 | |
| 山羊抗小鼠IgG | ZSGB Biotech | ZF-0312 | |
| Western blotting | 上样缓冲液 | Solarbio | -- |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | ZSGB Biotech | ZB-2301 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | ZSGB Biotech | ZB-5305 | |
| ELISA | CHIKV E1蛋白 | ProSpec | PRS-chi-004 |
| CHIKV E2蛋白 | Sino Biological | 40440-V08B100 | |
| WNV-E-DIII蛋白 | Sino Biological | 40345-V08Y-100 | |
| 蚀斑减少中和试验 | 微晶纤维素Avicel | -- | -- |
| 结晶紫溶液 | Solarbio | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism 9 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗原表达验证 | 感染复数：0.1 MOI；IFA固定时机：细胞病变50-60%；WB收样时机：细胞病变90%；使用的抗体及编号 阅读提示：Methods 中的 'Indirect immunofluorescence assay' 和 'Western blotting' 小节 |
| 动物免疫 | 小鼠品系和性别：雌性C57BL/6，6-8周龄；免疫途径：肌内注射，50 μL；剂量：低剂量2×10^8 vp/只、高剂量1×10^9 vp/只；对照：Ad5-GFP 1×10^9 vp/只；免疫后采血时间：2周 阅读提示：Methods 中的 'Animal experiments' 小节和 Figure 2 图注 |
| 体液免疫检测 | ELISA抗原包被量：50 ng/孔；中和试验方法：WNV假病毒中和试验和CHIKV PRNT；PRNT中Vero细胞密度、病毒量和覆盖物浓度 阅读提示：Methods 中的 'Enzyme-linked immunosorbent assay' 和 'Pseudovirus neutralization test'、'Plaque reduction neutralization test' 小节 |
| 细胞免疫检测 | 刺激肽序列及浓度；ELISpot计数单位；ICS中脾细胞浓度、抗体组合 阅读提示：Methods 中的 'ELISpot' 和 'Intracellular cytokine staining' 小节 |