建立SARS-CoV-2感染模型
确认K18-hACE2小鼠对鼻内SARS-CoV-2感染的易感性和病理特征,作为接触传播实验的供体。
向K18-hACE2小鼠鼻内接种1×10^5 PFU SARS-CoV-2,观察临床症状、存活率、肺部病理和病毒载量。
Adult K18-hACE2 mice are suitable for studying intranasal SARS-CoV-2 infection but not direct-contact transmission.
包含体外细胞培养病毒、小鼠体内感染、病理学、免疫组化、病毒载量检测及中和抗体检测等实验,但未对接触传播机制进行深入验证。
C57BL/6背景K18-hACE2小鼠 FVB/NJ背景K18-hACE2小鼠 丝裂霉素C诱导免疫缺陷的FVB/NJ背景K18-hACE2小鼠
使用1×10^5 PFU SARS-CoV-2鼻内感染供体小鼠 共饲养48小时,在供体感染后2天或6天开始接触 在接触后2、7、14天处死小鼠进行检测 免疫缺陷通过腹腔注射丝裂霉素C诱导(0.02 mg/只/天,3天后0.001 mg/只/天)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确认K18-hACE2小鼠对鼻内SARS-CoV-2感染的易感性和病理特征,作为接触传播实验的供体。
向K18-hACE2小鼠鼻内接种1×10^5 PFU SARS-CoV-2,观察临床症状、存活率、肺部病理和病毒载量。
评估未感染小鼠与感染小鼠共同饲养后是否发生接触传播。
将未感染的K18-hACE2小鼠与鼻内感染SARS-CoV-2的供体小鼠(感染后2天或6天)共同饲养48小时,然后分开,并在接触后2、7、14天对接触鼠进行综合检测。
测试免疫抑制是否会增加接触传播的风险。
用丝裂霉素C处理FVB/NJ背景K18-hACE2小鼠诱导免疫缺陷,然后与感染供体共饲养,检测病毒和免疫应答。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒培养 | Vero细胞 | Korean Cell Line Bank | KCLB 10081 |
| 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| 病毒滴定 | SeaPlaque琼脂糖 | Lonza | -- |
| 动物实验 | Zoletil-隆朋混合剂 | -- | -- |
| 组织固定 | 10%中性缓冲福尔马林 | Sigma | F5554 |
| 组织切片 | 切片机 | Leica | -- |
| 染色 | 迈耶氏苏木素 | Agilent | 3309 |
| 曙红Y | Sigma | F5554 | |
| 封片 | 封片剂 | Thermo Scientific | 6769007 |
| 显微镜 | 光学显微镜 | Olympus | BX43 |
| 免疫组织化学 | 抗原修复液 | Agilent | S1699 |
| 蛋白封闭液 | Agilent | X0909 | |
| 小鼠免疫组织化学试剂盒 | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| 抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗体 | Sino Biological | 40143-MM08 | |
| 抗F4/80抗体 | Cell Signaling Technology | 70076 | |
| 抗CD3b抗体 | Abcam | ab5690 | |
| 抗PTPRC抗体 | Abcam | ab64100 | |
| 抗中性粒细胞抗体 | Abcam | ab2557 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Agilent | K4001 | |
| 生物素化抗大鼠IgG | Vector | -- | |
| 亲和素-生物素复合物试剂 | Vector | -- | |
| DAB显色液 | Agilent | K3468 | |
| 原位杂交 | RNAscope 2.5 HD Red检测 | Advanced Cell Diagnostics | -- |
| 扩增试剂 | ACD | 322360 | |
| 血液分析 | 血液分析仪 | Mindray Global | BC-5000 |
| 动物管理 | 植入式可编程温度应答器 | Bio Medic Data Systems | IP55-300 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒培养和滴定 | Vero细胞系来源(KCLB 10081)和培养条件;SARS-CoV-2毒株(NCCP 43326,S型)和滴度测定方法 阅读提示:Materials and Methods - Virus |
| 动物模型 | K18-hACE2小鼠的遗传背景(C57BL/6或FVB/NJ)和来源;小鼠年龄(9周龄)和性别(雄性) 阅读提示:Materials and Methods - Animals |
| 感染和接触 | 鼻内感染剂量(1×10^5 PFU)和接种途径;共饲养开始时间(供体感染后2或6天)和持续时间(48小时);接触鼠的处死时间点(2,7,14天) 阅读提示:Materials and Methods - Contact-transmission model |
| 免疫抑制 | 丝裂霉素C剂量(0.02 mg/只/天,随后0.001 mg/只/天)和给药方式(腹腔注射)及持续时间 阅读提示:Materials and Methods - MMC treatment |
| 病毒检测 | 空斑实验和RT-qPCR的检测方法和阈值(Ct值) 阅读提示:Materials and Methods - Virus; Figure S5 |