抗体分离与假病毒中和谱测定
鉴定具有广谱中和活性的单克隆抗体。
从COVID-19康复者B细胞中分离抗体，通过VSV假病毒中和实验测定pT1679对多种SARS-CoV-2变体和蝙蝠/穿山甲沙贝科病毒的中和能力。
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保守RBD表位中的一个关键残基决定具有周期性YYDRxxG基序的泛沙贝科病毒抗体的中和广度
A critical residue in a conserved RBD epitope determines neutralization breadth of pan-sarbecovirus antibodies with recurring YYDRxxG motifs.
实验完整度
高包含体外假病毒中和实验、ELISA结合实验、SPR亲和力测定、冷冻电镜结构解析、定点突变研究及叙利亚仓鼠体内攻毒保护实验，并涉及多种蝙蝠和穿山甲沙贝科病毒。
主要模型
VSV假病毒系统 HEK293T细胞 Vero76细胞 叙利亚仓鼠模型
重点核对
抗体pT1679的IgG浓度范围：5000 ng/mL起，8步5倍梯度稀释至0.064 ng/mL RBD残基384的突变（如SARS-CoV A371P、LYRa11 A375P、Rs7327 A372P） 假病毒滴度范围：104-105 TCID50/mL，某些病毒（BANAL-20-236, RaTG13, RsSHC014）最高103 TCID50/mL 叙利亚仓鼠攻毒剂量：104 TCID50的SARS-CoV-2 D614G或Omicron BA.1分离株
摘要
大流行性冠状病毒的出现仍然是一个全球健康问题，凸显了对能够靶向多种沙贝科病毒的广谱中和抗体（bnAbs）的需求。在本研究中，我们分离并表征了一种新型抗体pT1679，它表现出卓越的中和广度。该抗体可预防SARS-CoV-2关注变体（如Omicron BA.1）的感染，并有效中和展示来自多种SARS-CoV-2变体以及各种蝙蝠和穿山甲沙贝科病毒（包括SARS-CoV样和SARS-CoV-2样病毒）的S蛋白的假病毒。此外，pT1679降低了感染叙利亚仓鼠肺部的病毒载量，并预防了SARS-CoV-2感染典型的严重肺部病理。pT1679与SARS-CoV-2 S复合物的冷冻电镜结构揭示，该抗体利用YYDRxxG基序识别RBD上一个高度保守的表位。通过详细的结构分析、突变研究和结合实验，我们确定了RBD残基384是抗体识别的关键决定因素。对几种相关bnAbs（如COVA1-16）的结构-功能分析使得YYDRxxG抗体被分为两类，它们在中和广度上存在差异。我们的发现为广谱沙贝科病毒中和的分子基础提供了关键见解，并为未来沙贝科病毒暴发中选择治疗性抗体提供了策略指导。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何鉴定和表征能够广谱中和多种沙贝科病毒的抗体，并理解其分子基础？
- 核心机制
- pT1679通过其长CDRH3中的YYDRxxG基序识别RBD上高度保守的表位，RBD残基384（SARS-CoV-2编号）是关键决定因素；YYDRxxG抗体可分为两组，组1耐受P384A，组2严格偏好脯氨酸，从而影响中和广度。
- 主要证据
- 假病毒中和实验显示pT1679中和多种沙贝科病毒；ELISA显示其结合广泛S蛋白；冷冻电镜结构解析了pT1679与S蛋白的复合物；突变RBD结合实验揭示P384的关键作用；叙利亚仓鼠实验证明pT1679降低病毒载量和肺部病理。
- 研究意义
- 研究提供了预测新兴沙贝科病毒对YYDRxxG抗体敏感性的框架，并提出筛选候选抗体对抗P384A突变体作为评估中和广度的替代实验，以加速广谱bnAbs的识别和临床开发，增强对未来暴发的准备。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
结合谱分析
评估pT1679与不同沙贝科病毒S蛋白的结合能力。
通过ELISA检测pT1679与重组S蛋白的结合，覆盖多个沙贝科病毒和MERS-CoV。
结构解析
确定pT1679与SARS-CoV-2 S蛋白的相互作用模式。
利用冷冻电镜解析pT1679 Fab与SARS-CoV-2 S三聚体复合物的结构，分辨率3.27 Å。
YYDRxxG抗体分组与关键残基验证
探究RBD残基384对YYDRxxG抗体中和广度的影响。
测试六种YYDRxxG抗体（pT1679, ADI-62113, C022, COVA1-16, G32Q4, VacW-209）对多种沙贝科病毒的假病毒中和，并通过ELISA检测对野生型和突变RBD的结合。
体内保护实验
评估pT1679在叙利亚仓鼠模型中对SARS-CoV-2感染的保护效果。
仓鼠腹腔注射pT1679或同型对照抗体（10 mg/kg或25 mg/kg），24小时后鼻内攻毒SARS-CoV-2 D614G或Omicron BA.1，4天后分析病毒载量和肺部病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 41966-029 |
| 胎牛血清 | Sigma | F7524 | |
| 青霉素-链霉素 | Cytogen | 06-07100 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Cytogen | 10-023 | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 博来霉素 | -- | -- | |
| 潮霉素 | -- | -- | |
| 蛋白表达 | ExpiFectamine 293转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 蛋白纯化 | Strep-Tactin XT 4Flow层析柱 | IBA Lifesciences | -- |
| Superose 6 increase凝胶过滤柱 | Cytiva | -- | |
| Superdex 75 increase 10/300凝胶过滤柱 | Cytiva | -- | |
| Superdex 200 increase 26/600凝胶过滤柱 | Cytiva | -- | |
| Superdex 200 increase 10/300凝胶过滤柱 | Cytiva | -- | |
| IgG纯化 | Protein G层析柱 | Cytiva | -- |
| ELISA | Nunc 96孔ELISA板 | Thermo Scientific | -- |
| TMB底物 | BioLegend | -- | |
| ELx808酶标仪 | BioTek | -- | |
| 假病毒中和实验 | 细胞裂解液 | PJK | 102517 |
| 萤火虫荧光素酶底物 | PJK | 102511 | |
| Orion II发光检测仪 | Berthold | -- | |
| GloMax发光检测仪 | Promega | -- | |
| SPR | Biacore 3000 | GE Healthcare | -- |
| CM5传感芯片 | Cytiva | -- | |
| Strep-TactinXT | IBA Life Sciences | -- | |
| Twin-Strep-Tag捕获试剂盒 | IBA Life Sciences | -- | |
| 冷冻电镜 | Titan Krios透射电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| K3直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| Gatan BioQuantum能量过滤器 | Gatan | -- | |
| EPU软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| QF R2/1 Au载网 | Quantifoil | -- | |
| Vitrobot IV | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 动物实验 | SARS-CoV-2 NP抗体 | Sino Biological | 40143-MM05 |
| Dako EnVision+聚合物系统 | Dako Agilent Pathology Solutions | -- | |
| 蛋白表达 | Insect-Xpress培养基 | Lonza | -- |
| 抗体表达 | pcDNA3.1表达载体 | Twist Biosciences | -- |
| 蛋白表达 | pCoPuro质粒 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：HEK293T, HEK293T-ACE2, Vero76, BHK-21(G43)；培养基：DMEM含10% FCS；添加物：0.5 µg/mL嘌呤霉素（HEK293T-ACE2），100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素（Vero76），100 µg/mL zeocin和50 µg/mL潮霉素（BHK-21(G43)）；传代比例：1:10每周2次或3次；培养条件：37°C, 5% CO2 阅读提示：Materials and Methods, Cell culture |
| 假病毒中和实验 | VSV假病毒生产：HEK293T细胞转染8 µg S蛋白表达质粒，18小时后用VSV*ΔG-fLuc(VSV-G)转导，24小时收获；中和实验：细胞（Vero76或HEK293T-ACE2）铺板，抗体稀释梯度（起始5 µg/mL，5倍稀释），孵育30分钟，感染20小时，检测荧光素酶活性；IC50计算：GraphPad Prism非线性回归 阅读提示：Materials and Methods, Pseudotype neutralization assays |
| ELISA结合实验 | 包被：S三聚体100 ng/孔或RBD 125 ng/孔，4°C过夜；封闭：PBS-T含5%脱脂牛奶；抗体浓度：S三聚体2 µg/mL，RBD 0.625 µg/mL；二抗：HRP-conjugated goat anti-human，稀释1:20,000-1:40,000；TMB显色10分钟，加1 M H3PO4终止，测OD450/630 阅读提示：Materials and Methods, ELISA binding assay |
| SPR | 仪器：Biacore 3000；温度25°C；运行缓冲液：10 mM HEPES pH7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Tween20；芯片：CM5上偶联Strep-TactinXT；分析物浓度：75, 50, 25, 10, 5 nM；再生：3 M盐酸胍 阅读提示：Materials and Methods, Surface plasmon resonance |
| 冷冻电镜 | 样品：SARS-CoV-2 S HexaPro 0.34 mg/mL与pT1679 Fab（5倍摩尔过量）孵育5-10分钟；载网：QF R2/1 Au mesh；仪器：Titan Krios 300 kV, K3探测器，能量过滤器；像素大小：0.68 Å；放大倍数130,000x；剂量率：15 counts/pixel/s 阅读提示：Materials and Methods, Cryo-EM sample preparation, data collection, data processing, and model building |
| 动物实验 | 叙利亚仓鼠（6-10周龄）；抗体腹腔注射10或25 mg/kg，体积500 µL；攻毒：鼻内104 TCID50 SARS-CoV-2 D614G或Omicron BA.1；24小时后攻毒；第4天安乐死；检测：肺和鼻甲中的TCID50，SARS-CoV-2 NP免疫组化，HE染色评分 阅读提示：Materials and Methods, Hamster challenge experiment |