感染模型建立与鞘脂组学分析
分析三种冠状病毒感染Huh-7-ACE2细胞后鞘脂变化
感染细胞在1、6、12 hpi收获，液相色谱-串联质谱定量31种鞘脂。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
靶向鞘脂代谢：抑制中性鞘磷脂酶2损害冠状病毒复制细胞器的形成
Targeting sphingolipid metabolism: inhibition of neutral sphingomyelinase 2 impairs coronaviral replication organelle formation.
实验完整度
高包含三种冠状病毒的脂质组学分析、药理学和siRNA敲低验证、时间添加实验、共定位分析、nsp3-4人工RO模型以及肺源细胞验证，形成多层级证据链。
主要模型
Huh-7-ACE2细胞 HCoV-229E、MERS-CoV、SARS-CoV-2感染模型 A549-ACE2细胞、A549-CD13细胞、MRC-5细胞 HCoV-229E nsp3-4表达的人工复制细胞器模型
重点核对
Huh-7-ACE2细胞感染三种冠状病毒（MOI=3） PDDC（10µM）处理时间（0-8 hpi） siRNA敲低nSMase2（100 nM） nsp3-4质粒转染（0.75 µg DNA） PDDC浓度（10 µM）
摘要
许多正链RNA病毒，包括冠状病毒，通过特定的膜相关病毒非结构蛋白（nsp）在受感染细胞的细胞质中协调形成专门的复制细胞器。这一过程涉及细胞内膜区室的广泛重组，并被认为依赖于一组特定的细胞酶，这些酶合成或修饰细胞脂质。在此，我们研究了特定鞘脂及相关酶在冠状病毒复制中的潜在作用。我们在感染三种不同冠状病毒的细胞中观察到整体神经酰胺水平的可比增加，而鞘磷脂水平降低，提示鞘磷脂酶将鞘磷脂转化为神经酰胺的增强。为验证这一假设，我们使用药理学和遗传学方法靶向细胞鞘磷脂酶。从这些实验中获得的数据使我们得出结论：中性鞘磷脂酶2在Huh-7-ACE2细胞中冠状病毒复制的早期（但非进入）步骤中发挥关键作用。此外，中性鞘磷脂酶2抑制了病毒复制细胞器的形成，表明神经酰胺参与这些膜结构的形成。我们还证实中性鞘磷脂酶2和神经酰胺（而非鞘磷脂）与冠状病毒感染细胞中产生的复制细胞器或通过共表达冠状病毒nsp3和nsp4诱导的复制细胞器共定位。在不同的上皮细胞系统中，使用基因不同的冠状病毒，神经酰胺与冠状病毒复制细胞器的共定位始终可被证实，描述了潜在的细胞和病毒类型非依赖性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鞘脂及其代谢酶在冠状病毒复制中的作用，特别是中性鞘磷脂酶2是否参与复制细胞器的形成。
- 核心机制
- nSMase2将鞘磷脂转化为神经酰胺，神经酰胺作为结构成分参与复制细胞器的形成，支持病毒复制。
- 主要证据
- 三种冠状病毒感染导致神经酰胺水平升高和鞘磷脂降低；nSMase2抑制或敲低减少病毒复制和RO形成；nSMase2和神经酰胺与病毒及人工诱导的RO共定位。
- 研究意义
- 识别出可作为广谱抗病毒治疗靶点的鞘脂相关宿主因子，为开发针对新发冠状病毒的抗病毒疗法提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鞘磷脂酶抑制剂的抗病毒活性评估
评估酸性和中性鞘磷脂酶抑制对病毒复制的影响
使用ARC39、PCK310、GW4869、3-O-甲基鞘磷脂、PDDC处理感染细胞，或siRNA敲低，通过空斑实验或免疫荧光评估。
nSMase2作用时相分析
确定nSMase2影响病毒复制的时间点
在感染前后不同时间窗口添加PDDC（10µM），收集12 hpi上清测病毒滴度。
RO形成抑制实验
检测nSMase2抑制是否减少RO形成
感染后加入PDDC、K22或Py-2，8 hpi用dsRNA抗体染色，量化RO阳性细胞。
脂质与nSMase2共定位分析
验证神经酰胺和nSMase2与RO的亚细胞共定位
使用Cer抗体、Eqt-SM-oxGFP和nSMase2-eGFP，通过免疫荧光和共聚焦显微镜检测。
人工RO系统验证
在无病毒感染系统中验证nsp3-4诱导RO与神经酰胺的关联
转染HA-nsp3-4-V5及其突变体，通过免疫荧光、Western blot和电镜确认RO形成，并进行脂质组学和共定位分析。
肺源细胞系统验证
验证神经酰胺共定位和脂质变化在不同细胞类型中的保守性
在A549-ACE2、A549-CD13和MRC-5细胞中感染，进行共定位和鞘脂组学分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | PDDC | ProbeChem Biochemicals Co Ltd | -- |
| GW4869 | Sigma Aldrich | -- | |
| 3-O-甲基鞘磷脂 | Enzo Life Science | -- | |
| ARC39 | -- | -- | |
| PCK310 | -- | -- | |
| Py-2 | Merck Millipore | -- | |
| K22 | ProbeChem Biochemicals Co Ltd | -- | |
| 细胞活力检测 | 3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物（MTT） | Sigma Aldrich | -- |
| 免疫荧光 | 小鼠抗HCoV-229E核衣壳蛋白单克隆抗体 | Ingenasa | Batch 250609 |
| 小鼠抗SARS-CoV核衣壳蛋白单克隆抗体 | Invitrogen | MA5-29981 | |
| 小鼠抗双链RNA单克隆抗体（J2） | SCICONS English and Scientific Consulting Kft. | -- | |
| 小鼠抗HA单克隆抗体 | Invitrogen | 26183 | |
| 兔抗V5单克隆抗体 | Cell Signal Technology | 13202 | |
| 小鼠抗神经酰胺单克隆抗体 | Enzo | ALX-804-196-Z050 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H+L） | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG（H+L） | Invitrogen | A11005 | |
| Alexa Fluor 488 F(ab')2山羊抗兔IgG（H+L） | Invitrogen | A11070 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher | P36934 | |
| 脂质组学 | d7-二氢鞘氨醇 | Avanti Polar Lipids | -- |
| d7-鞘氨醇 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| d7-鞘氨醇-1-磷酸 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 17:0神经酰胺（d18:1/17:0） | Avanti Polar Lipids | -- | |
| d31-16:0鞘磷脂（d18:1/16:0-d31） | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 17:0葡萄糖基(β)神经酰胺（d18:1/17:0） | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 17:0乳糖基(β)神经酰胺（d18:1/17:0） | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 1290 Infinity II高效液相色谱仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Poroshell 120 EC-C8色谱柱 | Agilent Technologies | -- | |
| 6495C三重四极杆质谱仪 | Agilent Technologies | -- | |
| siRNA敲低 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 小干扰RNA（aSMase/SMPD1） | Sigma Aldrich | EHU122691 | |
| 小干扰RNA（nSMase1/SMPD2） | Sigma Aldrich | EHU120741 | |
| 小干扰RNA（nSMase2/SMPD3） | Sigma Aldrich | EHU024631 | |
| 小干扰RNA（nSMase3/SMPD4） | Sigma Aldrich | EHU116241 | |
| 小干扰RNA（CD13/ANPEP） | Sigma Aldrich | EHU037211 | |
| 小干扰RNA（ACE2） | Sigma Aldrich | EHU033081 | |
| 小干扰RNA（DPP4） | Sigma Aldrich | EHU058011 | |
| MISSION小干扰RNA通用阴性对照1 | Sigma Aldrich | SIC002 | |
| RT-qPCR | RNeasy Midi试剂盒 | Qiagen | -- |
| 4× CAPITAL 1步qRT-PCR绿色预混液 | Biotechrabbit | -- | |
| Luna通用一步法RT-qPCR试剂盒 | NEB | -- | |
| 质粒转染 | pcDNA3.1载体 | BioCat | -- |
| pcDNA3.1 | Addgene | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| Western blot | 十二烷基麦芽糖苷 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | -- | |
| 山羊抗兔IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | |
| 山羊抗小鼠IRDye 680CW | LI-COR | 926-68070 | |
| LI-COR Odyssey成像系统 | LI-COR | -- | |
| 电子显微镜 | PEI STAR转染试剂 | Tocris Bioscience | -- |
| 醋酸铀酰 | Merck | -- | |
| AGAR 100树脂 | Agar Scientific Ltd | -- | |
| LEO EM 906透射电子显微镜 | LEO Elektronenmikroskopie GmbH-Zeiss | -- | |
| 慢扫描2K CCD相机 | TRS | -- | |
| 免疫荧光 | Imaris 8.4软件 | Bitplane | -- |
| 数据分析 | GraphPad Prism 9.2 | GraphPad Software | -- |
| MassHunter软件（版本10.1） | Agilent Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与病毒感染 | 细胞类型（Huh-7-ACE2、A549-ACE2、A549-CD13、MRC-5）、MOI值、感染时间 阅读提示：Materials and Methods: Cells and viruses |
| 抑制剂处理 | PDDC浓度、处理时间窗口、DMSO对照 阅读提示：Materials and Methods: Inhibitors; Results: nSMase2 activity supports an early step |
| siRNA敲低 | siRNA浓度（100 nM，CD13为50 nM）、转染时间（48h预处理）、靶基因 阅读提示：Materials and Methods: siRNA-based knockdowns |
| 鞘脂组学分析 | 感染MOI（3）、收获时间点、细胞数量（1×10^6）、内标种类、LC-MS/MS条件 阅读提示：Materials and Methods: Quantification of sphingolipids by LC-MS/MS |
| 免疫荧光与共定位 | 固定剂（PFA+Triton X-100或皂苷）、抗体稀释度（1:100）、二抗稀释度（1:500）、Manders系数计算 阅读提示：Materials and Methods: Immunofluorescence |
| 人工RO系统 | 质粒DNA量（0.75µg）、转染试剂（Lipofectamine 2000）、转染时间（24h） 阅读提示：Materials and Methods: Plasmid construction and transfection |