建立致死性SFTSV小鼠感染模型
建立可用于疫苗效力评估的致死性SFTSV感染模型并确定病毒致死剂量。
使用MAR1-5A3抗体处理C57BL/6J小鼠，以暂时抑制I型干扰素反应，接种不同剂量（0.1至1000 TCID50）的SFTSV YL-1株，观察体重变化和存活率，计算LD50。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一种复制型RNA疫苗可保护小鼠免受严重发热伴血小板减少综合征病毒感染
A replicating RNA vaccine protects against severe fever with thrombocytopenia syndrome virus infection in mice.
实验完整度
高包含体外蛋白表达验证、小鼠免疫原性评估、致死性SFTSV攻击保护实验、病毒载量检测、组织病理学及原位杂交分析，并借助TRIM21基因敲除小鼠进行机制验证，证据层级丰富。
主要模型
C57BL/6J小鼠（MAR1-5A3处理模型） TRIM21基因敲除小鼠 BHK-21细胞 Vero细胞
重点核对
MAR1-5A3抗体处理小鼠以抑制I型干扰素信号 SFTSV YL-1株攻击剂量（100 TCID50） 疫苗剂量（2.5 µg或5 µg repRNA）和接种途径（肌内注射） 实验组设置（sham, repNP, repGPC, repNP+repGPC） TRIM21基因敲除小鼠的使用
摘要
目前已批准用于严重发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）的疫苗尚未出现。SFTSV是一种蜱传RNA病毒，病死率为5%至30%，被世界卫生组织视为优先病原体。在此，我们评估了一种复制型RNA（repRNA）疫苗在小鼠中对致死性SFTSV攻击的保护作用。我们发现，repRNA表达的SFTSV核蛋白（repNP）或糖蛋白前体（repGPC）均可提供保护，确定了二者为SFTSV疫苗开发中的保护性抗原。此外，我们的repNP疫苗的保护作用需要胞内Fc受体TRIM21以获得最佳保护效果，这拓展了抗NP抗体和TRIM21在控制布尼亚病毒中的作用。我们的数据支持该疫苗针对SFTSV的持续开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估基于复制型RNA（repRNA）平台表达的SFTSV核蛋白（NP）或糖蛋白前体（GPC）疫苗对小鼠致死性SFTSV攻击的保护效力，并探究NP疫苗保护作用的分子机制。
- 核心机制
- repNP疫苗诱导的保护作用部分依赖于胞内Fc受体TRIM21，可能通过TRIM21介导的抗体依赖性细胞内中和机制限制病毒复制。
- 主要证据
- 在小鼠模型中，repNP和repGPC均能提供完全保护；TRIM21敲除小鼠中repNP的保护效力显著降低，表现为严重体重减轻和部分死亡，而repGPC保护性不受影响。
- 研究意义
- 该研究确定了SFTSV NP和GPC均可作为疫苗抗原，支持该repRNA疫苗进入进一步开发，并提示靶向布尼亚病毒NP的抗体和TRIM21介导的保护机制可能具有广谱性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估疫苗的免疫原性
评估repNP、repGPC及组合疫苗诱导的体液和细胞免疫应答。
对小鼠进行prime-boost免疫（间隔28天），收集血清和脾细胞，通过ELISA检测抗体，ELISpot检测T细胞反应。
评估疫苗对致死性SFTSV攻击的保护效力
评估疫苗对致死性SFTSV攻击的保护效果，包括存活率、体重变化和病毒载量。
免疫小鼠在攻击前一天用MAR1-5A3处理，感染100 TCID50 SFTSV YL-1，监测存活和体重，在第5天对部分小鼠安乐死，检测组织病毒载量。
评估组织病理学变化
评估疫苗对SFTSV感染相关组织病变的保护作用。
在第5天收集脾、肝、肾组织，通过组织病理学染色和原位杂交（ISH）检测病毒RNA和病理变化。
评估双价疫苗
评估单RNA表达NP和GPC的双价疫苗的保护效力。
将NP和GPC编码于同一RNA上，免疫小鼠，进行挑战实验，与单独疫苗组合比较。
机制研究：TRIM21依赖性
探究repNP疫苗的保护作用是否依赖于TRIM21。
在WT和TRIM21−/−小鼠中进行vaccination和challenge，比较保护效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 疫苗表达验证 | Transit LT1转染试剂 | Mirus Bio | -- |
| AF488标记的抗鼠二抗 | Invitrogen | -- | |
| Nucblue核染料 | Invitrogen | -- | |
| 病毒培养 | 支原体清除试剂盒 | PromoKine | -- |
| qRT-PCR | RNeasy迷你提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| QIAamp病毒RNA迷你提取试剂盒 | Qiagen | -- | |
| Quantifast一步法qRT-PCR预混液 | Qiagen | -- | |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| Megascript体外转录试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| ELISpot | Immunospot小鼠IFN-γ单色酶联免疫斑点检测试剂盒 | -- | -- |
| 肽库 | Genscript | -- | |
| ELISA | 重组SFTSV核蛋白 | Sino Biological | 212-SFTSV0010 |
| 重组SFTSV Gn蛋白 | Acro Biosystems | GNN-S52H4 | |
| 抗鼠IgG检测抗体 | Southern Biotech | -- | |
| ABTS显色底物 | -- | -- | |
| 病毒中和实验 | 抗SFTSV Gn抗体 | Creative Biolabs | -- |
| AlexaFluor 488山羊抗人二抗 | Invitrogen | -- | |
| ZOE荧光细胞成像仪 | BioRad | -- | |
| 组织病理与ISH | RNAscope 2.5 VS检测试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | -- |
| RNAscope探针V-SFTSV-NP | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 449899 | |
| Discovery ULTRA载玻片染色系统 | Roche Diagnostics | -- | |
| 小鼠处理 | 抗I型干扰素受体单克隆抗体MAR1-5A3 | Leinco | -- |
| 异氟烷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒感染模型 | 小鼠品系、年龄、MAR1-5A3使用剂量和途径、病毒株、攻击剂量和途径 阅读提示：Methods：Animals, biosafety, and ethics; Viral stock |
| 疫苗免疫 | 疫苗剂量、免疫途径、prime-boost间隔时间、抗原编码序列 阅读提示：Methods：Vaccine repRNAs; Figure 1b |
| 免疫原性评估 | 血清采集时间、ELISA步骤、ELISpot步骤、肽库序列 阅读提示：Methods：ELISA; ELIspot |
| 病毒载量检测 | 组织采集时间、RNA提取方法、qRT-PCR引物和探针序列、标准曲线 阅读提示：Methods：Quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) |
| 组织病理与ISH | 组织固定和处理方法、RNAscope探针和试剂、染色方案 阅读提示：Methods：Histology |
| 机制研究 | TRIM21基因敲除小鼠来源、疫苗接种和挑战方案 阅读提示：Methods：Animals; Figure 5 |