优化交联剂和水凝胶配方
确定适合12倍膨胀的交联剂和凝胶成分，避免限制核膨胀。
测试了不同浓度的AcX和GA作为交联剂，以及不同水凝胶配方（MBAA和DMAA），测量了膨胀后的核尺寸。
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一步法4倍和12倍3D-ExM实现纳米级细胞结构的稳健超分辨显微镜成像
One step 4× and 12× 3D-ExM enables robust super-resolution microscopy of nanoscale cellular structures.
实验完整度
高包含体外细胞模型、3D类器官、患者来源类器官、病毒颗粒、临床样本等多种证据层级，并通过多种结构（微管、核孔复合体、着丝粒等）验证了方法的分辨率和各向同性。
主要模型
HeLa细胞 PtK2细胞 RPE1细胞 MCF-7类器官和患者来源类器官 iD98/HR1细胞（EBV阳性）
重点核对
4×和12× 3D-ExM水凝胶的膨胀倍数分别为约4倍和11-12倍。 使用相同成像条件（20×水镜，NA=0.95）进行相关前后3D-ExM成像，验证核的各向同性膨胀。 微管直径测量：12× 3D-ExM结合共聚焦显微镜达到约28 nm的横向分辨率。 核孔复合体（NPC）中Nup107双焦点距离约为67 nm。 EBV病毒颗粒外径和内径分别为162 nm和76 nm。
摘要
针对超分辨膨胀显微镜，优化了4倍和12倍3D-ExM方法，提供无需专用设备或条件的一步膨胀过程。我们严格验证了其稳健性、可重复性、各向同性，以及在不同亚细胞结构和微生物中的保存情况，使这些用户友好的技术广泛适用于细胞生物学研究。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何实现简单、稳健且各向同性的单步高倍膨胀显微镜方法，用于纳米级细胞结构的超分辨成像？
- 核心机制
- 通过优化交联剂（使用戊二醛替代AcX）和水凝胶配方（DMAA-SA），实现单步12倍膨胀，同时保持3D各向同性和结构保存。
- 主要证据
- 通过多种细胞模型（HeLa、PtK2、RPE1）和类器官验证核的3D各向同性膨胀；使用微管、核孔复合体、EBV病毒颗粒等结构验证分辨率；通过EBV和HIV-1病毒颗粒验证结构保存。
- 研究意义
- 3D-ExM提供低成本、用户友好的超分辨显微镜方法，适用于广泛的细胞生物学研究，包括细胞和染色质结构研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证核的3D各向同性膨胀
验证3D-ExM方法是否能够实现核的3D各向同性膨胀。
测量了相同细胞在膨胀前后的核尺寸（长轴、短轴、面积、体积），并计算了横向和轴向膨胀因子。
验证分辨率
确定12× 3D-ExM结合常规共聚焦显微镜所能达到的横向分辨率。
使用微管和核孔复合体作为“分子尺子”，测量其尺寸并与已知值比较。
验证结构保存
证明3D-ExM能够保存蛋白质和核酸结构，用于超分辨成像。
使用4×和12× 3D-ExM可视化EBV病毒颗粒、HIV-1基因组RNA、着丝粒和染色体。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫染色 | 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P3813 |
| NP40替代物 | SCBT | sc-29102 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 4× 3D-ExM凝胶制备 | 氯化钠 | Fisher BioReagents | BP358-212 |
| 丙烯酸钠 | Sigma-Aldrich | 408220 | |
| 蛋白质消化 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 |
| 十二烷基硫酸钠 | Roche | 1667289 | |
| 蛋白酶K | Thermo Fisher Scientific | EO0492 | |
| 材料 | 载玻片 | Avantor | 16005-106 |
| 方形模具 | Grace Bio-Labs | 664107 | |
| 方形盖玻片 | Corning | 2875-25 | |
| 矩形模具 | Grace Bio-Labs | 664103 | |
| 矩形盖玻片 | VWR | 10748-190 | |
| 细胞培养 | DMEM高糖培养基 | Cytiva | SH30243.01 |
| DMEM/F12培养基 | Cytiva | SH30261.01 | |
| RPMI培养基 | Cytiva | SH30255.01 | |
| EMEM培养基 | Gibco | 12492013 | |
| 基质胶 | Corning | 354230 | |
| 抗体 | 小鼠抗Plk1抗体 | Santa Cruz Biotech | sc17783 |
| 豚鼠抗CENP-C抗体 | MBL | PD030 | |
| 小鼠抗α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T6199 | |
| 小鼠抗Nup107抗体 | Abcam | ab24609 | |
| 兔抗Elys抗体 | SinoBiological | 205696-T10 | |
| 抗GP350抗体 | SinoBiological | 40373 | |
| 小鼠单克隆Gag抗体 | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | -- | |
| 大鼠抗小鼠IgG2a-生物素 | Thermo Fisher Scientific | 13-4210-80 | |
| 大鼠抗小鼠IgG1-生物素 | Thermo Fisher Scientific | 13-4015-80 | |
| Alexa 488偶联抗体 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152, 715-545-150, 706-155-148 | |
| 链霉亲和素偶联Alexa fluor 488 | Invitrogen | S32354 | |
| 链霉亲和素偶联Alexa fluor 568 | Invitrogen | S11226 | |
| DNA染色 | DAPI | Invitrogen | D1306 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Nuclear Green LCS1 | Abcam | ab138904 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | P1304MP | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher Scientific | 62251 | |
| 固定和染色 | PHEM缓冲液 | -- | -- |
| 病毒生产 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences Inc. | 23966 |
| 病毒感染 | DEAE-葡聚糖 | Millipore Sigma | 9064-91-9 |
| 成像 | Nikon Ti2显微镜 | Nikon | -- |
| Yokogawa SoRa CSU-W1转盘共聚焦 | Yokogawa | -- | |
| Hamamatsu Orca Flash4相机 | Hamamatsu | -- | |
| Plan Apo VC 60×水镜 (NA=1.20) | Nikon | -- | |
| Plan Apo 60×油镜 (NA=1.40) | Nikon | -- | |
| 20×水镜 (NA=0.95) | Nikon | -- | |
| Plan Apo 100×油镜 (NA=1.45) | Nikon | -- | |
| Nikon NIS元素软件 | Nikon | 5.21 | |
| Imaris软件 | Andor | 9.5.1 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 交联条件 | 交联剂类型（GA）和浓度（0.05%-2.1%），交联时间（12-16小时）。 阅读提示：Materials and methods 中的 "Fixation and staining for 3D-ExM" 部分。 |
| 凝胶配制 | 4×和12× 3D-ExM凝胶的配方（单体、交联剂、引发剂），膨胀时间。 阅读提示：Materials and methods 中的 "4× 3D-ExM gel" 和 "12× 3D-ExM gel" 部分。 |
| 消化步骤 | ProK浓度（16 U/ml），消化时间（4×: 3小时；12×: 24小时）。 阅读提示：Materials and methods 中的 "Protein digestion" 部分。 |
| 成像 | 成像设备（转盘共聚焦），物镜（60×水镜或油镜），Z轴步长（0.1-0.4 µm）。 阅读提示：Materials and methods 中的 "Imaging" 部分。 |
| 核膨胀验证 | 测量核的长轴、短轴、面积和体积，计算膨胀因子。 阅读提示：Materials and methods 中的 "Determination of the expansion factor of nucleus" 部分。 |