鉴定R15B与eIF2-eIF2B复合物的结合
验证R15B是否与eIF2结合并进一步与eIF2B复合物相互作用。
在Expi293和HEK293T细胞中表达FLAG标记的R15B片段，通过免疫沉淀和质谱鉴定共纯化蛋白。
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整合应激反应的终止
Termination of the integrated stress response.
实验完整度
高包含生化重建、诱变、冷冻电镜结构解析、功能去磷酸化实验等多个独立验证层次。
主要模型
Expi293细胞 HEK293T细胞 HeLa细胞
重点核对
R15B411-511片段用于结构研究，R15B414-713用于功能研究 FLAG标签免疫沉淀富集复合物 磷酸酶处理评估去磷酸化 冷冻电镜结构验证复合物构象
摘要
应激反应使细胞能够检测、适应并应对挑战。这些信号通路的有益性取决于其可逆性。整合应激反应（ISR）由翻译起始因子eIF2的磷酸化触发，磷酸化的eIF2（P-eIF2）捕获并抑制限速翻译因子eIF2B，从而减弱翻译起始。因此，该通路的终止需要将eIF2B从P-eIF2的抑制中释放出来。在这里，我们发现eIF2磷酸酶亚基PPP1R15A和PPP1R15B（R15B）与eIF2B结合的P-eIF2复合物结合。由天然eIF2-eIF2B和P-eIF2-eIF2B复合物与R15B结合的冷冻电镜结构指导的生化研究表明，R15B能够使eIF2B上原本无法去磷酸化的P-eIF2去磷酸化。这揭示了ISR终止的机制，表明R15B将eIF2B从P-eIF2的抑制中解救出来，从而保护翻译和细胞适应性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 整合应激反应如何被终止，细胞如何从P-eIF2对eIF2B的抑制中恢复翻译？
- 核心机制
- R15B直接与P-eIF2-eIF2B复合物结合，形成tether将eIF2γ和eIF2Bγ连接，使P-eIF2处于raised构象，随后R15B的C端区域催化P-eIF2去磷酸化，使eIF2从抑制位点释放并转移到催化位点，从而恢复eIF2B的GEF活性。
- 主要证据
- 通过冷冻电镜解析了天然R15B-P-eIF2-eIF2B复合物结构，结合生化实验证明R15B促进P-eIF2去磷酸化，且去磷酸化后复合物从抑制构象转变为催化构象。
- 研究意义
- 揭示了ISR终止的分子机制，表明R15B通过解救eIF2B来保护翻译和细胞适应性，为理解eIF2磷酸化相关疾病提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
解析天然eIF2-eIF2B复合物结构
确定eIF2和eIF2B在天然状态下的相互作用结构。
对FLAG-R15B414-713免疫纯化的复合物进行冷冻电镜分析，得到eIF2-eIF2B催化复合物的高分辨率结构。
解析R15B-P-eIF2-eIF2B复合物结构
揭示R15B与P-eIF2-eIF2B复合物的结合方式和构象变化。
使用R15B411-511片段纯化P-eIF2-eIF2B复合物，进行冷冻电镜分析，得到raised构象的结构。
验证R15B突变对复合物结合的影响
检验R15B的关键残基在结合eIF2-eIF2B复合物中的功能重要性。
生成R15B突变体（H2A、DLm1、DLm2、Q490E、Q490L、N423D），通过免疫共沉淀和定量分析检测其与eIF2和eIF2B的结合能力。
评估R15B对P-eIF2去磷酸化的功能
确定R15B是否能够促进eIF2B上P-eIF2的去磷酸化。
使用R15B414-713-KATA片段纯化复合物，进行碱性磷酸酶处理，通过SEC和免疫印迹检测P-eIF2α水平变化。
观察去磷酸化后的复合物构象变化
确认去磷酸化后复合物是否从抑制构象转变为催化构象。
对磷酸酶处理前后的R15B414-713-KATA-P-eIF2-eIF2B复合物进行冷冻电镜2D分类，比较构象。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Expi293表达培养基 | Thermo Fisher | A14351 |
| 杜氏改良Eagle培养基 | Sigma | D5796 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 转染 | Opti-MEM培养基 | Gibco | 11058 |
| PEI转染试剂 | Polysciences | 24765 | |
| PEIMAX | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2磁性微珠 | Sigma-Aldrich | M8823-1ML |
| Pierce抗DYKDDDDK磁性琼脂糖 | Thermo Fisher | A36798 | |
| FLAG多肽 | Merck | F3290 | |
| 蛋白分析 | Bolt 4-12% Bis-Tris Plus凝胶 | Invitrogen | NW04125BOX |
| InstantBlue考马斯亮蓝蛋白染液 | Abcam | ab119211 | |
| 蛋白纯化 | Superose 6 3.6/300色谱柱 | Cytiva | -- |
| ÄKTA Pure系统 | -- | -- | |
| 磷酸酶处理 | 碱性磷酸酶 | Merck | 10713023001 |
| 免疫印迹 | 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 1704159 |
| Amersham ECL Prime检测试剂盒 | GE Healthcare Life Sciences | RPN2232 | |
| 抗体 | eIF2α抗体 | Abcam | Ab26197 |
| eIF2α抗体 | Cell Signaling | L57A5 | |
| P-eIF2α抗体 | Abcam | Ab32157 | |
| eIF2β抗体 | ProteinTech | 10227-1-AP | |
| eIF2γ抗体 | Invitrogen | PA5-109680 | |
| eIF2Bα抗体 | ProteinTech | 18010-1-AP | |
| eIF2Bβ抗体 | ProteinTech | 11034-1-AP | |
| eIF2Bγ抗体 | SinoBiological | 200321-T40 | |
| eIF2Bδ抗体 | AssaybioTech | C19274 | |
| eIF2Bε抗体 | Abcam | Ab91565 | |
| Vinculin抗体 | Cell Signaling Technology | 4650S | |
| FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| PP1抗体 | Santa Cruz | Sc-7482 | |
| 克隆 | GeneArt String DNA片段 | Life Technologies Ltd | -- |
| QuickChange II定点突变试剂盒 | Agilent | 200523 | |
| 质谱 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 胰凝乳蛋白酶 | -- | -- | |
| 冷冻电镜 | Quantifoil 1.2/1.3网格 | -- | -- |
| UltrAuFoil 1.2/1.3网格 | -- | -- | |
| Titan Krios 3透射电子显微镜 | Thermo Fisher | -- | |
| Titan Krios 2透射电子显微镜 | Thermo Fisher | -- | |
| Falcon4i直接电子探测器相机 | -- | -- | |
| K3直接电子探测器相机 | Gatan | -- | |
| GIF Quantum能量过滤器 | -- | -- | |
| EPU软件 | Thermo Fisher | -- | |
| Vitrobot MK IV | FEI | -- | |
| 细胞培养 | Expi293细胞 | -- | -- |
| HEK293T细胞 | -- | -- | |
| HeLa细胞 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系和培养条件（Expi293、HEK293T、HeLa） 阅读提示：Materials and methods - Mammalian cells |
| 转染 | 质粒DNA和转染试剂剂量（PEI、PEIMAX） 阅读提示：Materials and methods - Transient transfection of Expi293 cells and HEK293T cells |
| 免疫沉淀 | FLAG抗体磁珠和洗脱条件 阅读提示：Materials and methods - FLAG immunoprecipitation from Expi293 cells |
| 磷酸酶处理 | 碱性磷酸酶处理的单位和时间（5或50单位，45分钟） 阅读提示：Materials and methods - Phosphatase treatment |
| 冷冻电镜 | 网格类型、样品浓度、数据收集参数 阅读提示：Materials and methods - Cryo-EM sample preparation and data collection |