CD33变体的体外表征
确认p.G156TfsTer5和p.P238QfsTer38变体是否为功能缺失，并评估其蛋白表达和分泌情况。
在HEK293F细胞中瞬时转染CD33M、G156TfsTer5和P238QfsTer38构建体，通过FACS检测表面表达，通过Western blot检测细胞裂解液和培养基中的蛋白分泌。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
人CD33缺乏与外周血白细胞计数的轻微改变相关
Human CD33 deficiency is associated with mild alteration of circulating white blood cell counts.
实验完整度
高包含体外表达与分泌验证、RBG回访表型分析（含FACS细胞亚群分析）以及两个生物库的PheWAS分析，多个独立证据层级相互验证。
主要模型
HEK293F细胞系 PBMC（外周血单个核细胞） 巴基斯坦基因组资源队列 英国生物库队列
重点核对
HEK293F细胞的CD33变体表达与分泌验证（G156TfsTer5和P238QfsTer38） 通过Sanger测序确认的携带者状态与合子性 PBMC中CD33表面表达和免疫细胞亚群的流式细胞术分析 血清CD33蛋白水平的MSD定量检测 PGR和UKBB生物库的PheWAS关联分析
摘要
单次跨膜蛋白CD33在吞噬性和造血细胞类型（如单核细胞）中富集。CD33被认为与免疫细胞功能、阿尔茨海默病易感性和罕见白血病相关。CD33的拮抗或基因消融已被提议用于治疗阿尔茨海默病、血液系统癌症，并作为富集基因改造血细胞的选择机制。为了解慢性CD33缺失或消融的影响，我们描述了经确认因种系功能缺失变异而缺失CD33的个体。通过基于PheWAS的方法利用现有全外显子组生物库，以及使用回忆基因型（RBG）研究的定制表型分析，我们表明CD33功能缺失会改变循环白细胞计数和分布，尽管程度轻微且无明显临床病理。这些发现表明，慢性CD33拮抗/消融在人类中可能是安全的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类种系CD33功能缺失是否导致临床表型或血液学改变？
- 核心机制
- CD33功能缺失导致造血细胞表面CD33表达缺失，并伴有循环白细胞（特别是单核细胞和T细胞）比例的轻微改变，但未发现明确疾病机制。
- 主要证据
- 通过RBG研究确认3名p.G156TfsTer5纯合子携带者，FACS显示其PBMC中CD33表达缺失，且单核细胞比例升高、T细胞比例降低；PheWAS分析显示UKBB中CD33 pLOF与白细胞、血小板、淋巴细胞等计数显著降低，但效应量很小。
- 研究意义
- 慢性CD33拮抗或消融在人类中可能安全，为相关治疗策略提供风险评估依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
回忆基因型研究：确认携带者并评估表型
确认CD33变体携带者，评估其血清CD33水平、PBMC免疫细胞亚群和系统临床表型。
从PGR中召回携带者，通过Sanger测序确认基因型，通过MSD检测血清CD33，通过FACS分析PBMC，并收集47项表型数据。
PheWAS分析（PGR和UKBB）
在大规模队列中测试CD33功能缺失变异是否与血液学及其他表型相关。
在PGR和UKBB的整个外显子组数据中，对CD33 pLOF变异进行负担PheWAS，分析定量和二元表型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 体外表达研究 | pRS5a表达载体 | GeneWiz | -- |
| 细胞培养 | FreeStyle 293表达培养基 | Invitrogen | -- |
| 聚乙烯亚胺25K | Polysciences | -- | |
| FACS分析 | 抗CD33抗体WM53-PE | Abcam | ab233577 |
| 抗CD33抗体HIM3-4（PE-Cy5） | Abcam | ab169823 | |
| FACS缓冲液（含1%胎牛血清和1%山羊血清的DPBS） | -- | -- | |
| Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| MSD binding assays | 抗CD33单克隆抗体3D6 | Abcam | ab11031 |
| hSGL3（重组抗CD33单克隆抗体） | -- | -- | |
| 标准结合96孔MSD板 | MesoScaleDiscovery | -- | |
| KPL牛奶稀释液/封闭液 | SeraCare Life Science | 5140-0010 | |
| TBS-Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| MSD山羊抗小鼠IgG硫标签抗体 | MesoScaleDiscovery | R32AC-1 | |
| MSD读数缓冲液T | MesoScaleDiscovery | R92TC-2 | |
| FACS分析 | Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 |
| CD45-BUV395 | BD | 563792 | |
| CD33-APC | Biolegend | 366626 | |
| Live/Dead可固定近红外染料 | Life Technology | L34992 | |
| CD3-BV421 | Biolegend | 317344 | |
| CD14-FITC | BD | 561712 | |
| CD19-PE | Biolegend | 302208 | |
| FlowJo V10 | BD | -- | |
| 回忆基因型研究 | Platinum预混液 | Thermo Scientific | -- |
| ExoSAP-IT Express PCR产物纯化试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| BigDye XTerminator | Thermo Scientific | -- | |
| Applied Biosystems SeqStudio遗传分析仪 | Thermo Scientific | -- | |
| PBMC分离 | Ficoll-Paque密度1.077培养基 | GE Healthcare | 17-5442-02 |
| Cryostore CS10 | Stemcell Technologies | 100-1061 | |
| Mr. Frosty细胞冷冻盒 | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| MSD binding assays | rT16-PA兔抗人CD33多克隆抗体 | SinoBiological | 12238-T16 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外表达研究 | 细胞系（HEK293F）、转染条件（质粒DNA量、PEI量、时间）、检测抗体（WM53-PE、HIM3-4） 阅读提示：Methods: In vitro expression studies; Figure 1 |
| FACS分析 | 抗体克隆、荧光标记、浓度、样品处理（PBMC分离）、门控策略 阅读提示：Methods: FACS analysis; Figure 7 |
| MSD结合实验 | 捕获抗体（hSGL3）和检测抗体（3D6或mSGL3）、血清稀释、孵育时间、MSD板类型 阅读提示：Methods: MSD binding assays; Figures 4 and 5 |
| 回忆基因型研究 | 目标变异位点、Sanger测序引物、PCR条件、测序平台 阅读提示：Methods: Recall by genotype study; Sanger sequencing |
| PheWAS分析 | 遗传模型（加性/隐性）、变异过滤标准、表型定义、协变量调整、多重检验校正 阅读提示：Methods: Exome analysis; UK Biobank dataset analyses |