鉴定与LILRB5结合的Eph受体
筛选并验证能结合并激活LILRB5的Eph受体。
使用LILRB5报告细胞、细胞结合实验和生物层干涉法，测试多种Eph受体与LILRB5的结合和激活。
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Eph受体激活髓系检查点受体LILRB5以支持肿瘤发展
Eph Receptors Activate Myeloid Checkpoint Receptor LILRB5 to Support Tumor Development.
实验完整度
高包含体外结合实验、报告细胞实验、信号通路研究、患者样本体外功能实验及转基因小鼠体内肿瘤模型等多个证据层级，且有功能验证和机制验证。
主要模型
MC38小鼠结肠癌细胞系 LLC小鼠肺癌细胞系 293T细胞系 THP-1细胞系 髓系特异性LILRB5转基因C57BL/6小鼠 癌症患者外周血样本
重点核对
Eph受体（EphA7、EphB1）与LILRB5的结合及激活 LILRB5信号传导机制（ITIM磷酸化） LILRB5在髓系细胞上的表达模式 Eph受体对MDSC免疫抑制功能的体外影响 体内肿瘤模型中LILRB5信号对肿瘤生长和免疫细胞的影响
摘要
免疫抑制性髓系细胞是T细胞为中心的免疫检查点阻断疗法的主要障碍，该疗法已成功治疗部分癌症患者。肿瘤细胞如何与髓系细胞相互作用以调节免疫反应和肿瘤发展尚不清楚。在此，我们报道某些膜酪氨酸激酶Eph受体，包括EphA7和EphB1，特异性结合免疫抑制性受体白细胞免疫球蛋白样受体家族B5（LILRB5）和白细胞免疫球蛋白样受体家族B2（LILRB2）。这些Eph受体诱导LILRB5介导的信号激活，LILRB5也激活Eph受体信号。LILRB5的激活促进了癌症患者髓系细胞上免疫抑制标志物的表达，并抑制了激活标志物的表达。在转基因小鼠中髓系细胞特异性表达LILRB5时，肿瘤细胞上的Eph受体与髓系细胞上的LILRB5之间的相互作用导致肿瘤生长增加、免疫抑制性髓系细胞增加，以及功能性T细胞频率降低，与对照小鼠相比。Eph诱导的LILRB5信号和功能被LILRB5阻断逆转。总之，某些Eph受体与髓系检查点受体LILRB5功能性相互作用，导致双向信号传导，LILRB5在支持免疫抑制性髓系细胞和维持肿瘤发展中发挥重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤细胞如何通过Eph受体与髓系细胞上的LILRB5相互作用来调节免疫反应和肿瘤发展？
- 核心机制
- Eph受体（如EphA7和EphB1）与LILRB5结合，激活LILRB5介导的信号，同时LILRB5也激活Eph受体信号，形成双向信号通路；LILRB5信号促进髓系细胞的免疫抑制表型，抑制抗肿瘤免疫，从而支持肿瘤生长。
- 主要证据
- 体外结合实验、报告细胞实验和信号传导实验证实EphA7/EphB1与LILRB5结合并诱导双向信号；患者MDSCs体外实验显示EphA7/EphB1上调免疫抑制标志物，抗LILRB5抗体逆转该效应；转基因小鼠肿瘤模型显示EphA7/EphB1表达肿瘤在LILRB5转基因小鼠中生长更快，伴随免疫抑制细胞增加和CD8+T细胞减少，抗LILRB5抗体抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示了Eph受体与LILRB5之间的功能性相互作用，为靶向LILRB5的癌症免疫治疗提供了新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
开发LILRB5阻断抗体
生成特异性阻断LILRB5功能的抗体。
通过噬菌体展示筛选人源scFv，转换为全人源IgG，并评估亲和力、特异性和阻断活性。
验证双向信号传导
验证Eph受体与LILRB5结合是否诱导双向信号传导。
共培养表达LILRB5和Eph受体的293T细胞，检测LILRB5磷酸化；用LILRB5-ECD处理表达Eph受体的细胞，检测Eph受体磷酸化。
检测LILRB5表达模式
明确LILRB5在不同免疫细胞亚群中的表达。
使用流式细胞术检测健康供者和癌症患者外周血中LILRB5的表达。
体外功能实验
验证Eph受体激活LILRB5对髓系细胞功能的影响。
用EphA7/EphB1处理THP-1-LILRB5细胞和患者MDSCs，检测IL-8分泌和免疫抑制标志物表达；用抗LILRB5评估逆转效果。
体内肿瘤模型
验证Eph受体与LILRB5相互作用对肿瘤生长和免疫浸润的影响。
将表达EphA7或EphB1的MC38或LLC细胞皮下植入WT或LILRB5转基因小鼠，测量肿瘤生长，分析免疫细胞；使用抗LILRB5或T细胞清除抗体处理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 10013CV |
| RPMI-1640培养基 | Corning | 10040CV | |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256701 | |
| 青霉素/链霉素 | Cytiva | SV30010 | |
| LILRB5报告细胞系 | -- | -- | |
| 细胞分选 | autoMACS细胞分选仪 | Miltenyi Biotec | 130-097-043 |
| 磁珠分选 | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| 细胞培养 | Lookout支原体PCR检测试剂盒 | Sigma | MP0035-1KT |
| 载体构建 | pLVX慢病毒表达载体 | Addgene | 110721 |
| pR26表达载体 | Addgene | 127372 | |
| EphB1 cDNA质粒 | R&D Systems | RDC0501 | |
| Fyn cDNA | Sino Biological | HG12346-UT | |
| Lyn cDNA | Sino Biological | HG10829-CY | |
| Yes cDNA | Sino Biological | HG16953-CY | |
| Blk cDNA | Sino Biological | HG10782-CY | |
| 抗体开发 | 人LILRB5胞外域蛋白 | Sino Biological | 17221-H08H |
| M13K07辅助噬菌体 | NEB | N0315 | |
| 高结合力96孔板 | Fisher Scientific | 21-377-203 | |
| HRP标记的抗M13抗体 | Sino Biological | 11973-MM05T-H | |
| In-Fusion HD克隆试剂盒 | Clontech | NC1454739 | |
| 抗体表达 | HEK293F细胞 | -- | -- |
| 抗体纯化 | Protein A树脂 | Repligen | 10-2500-01 |
| 亲和力测定 | Octet RED96仪器 | ForteBio | -- |
| 病毒包装 | psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 |
| pMD2G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| Polyjet转染试剂 | SignaGen | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 细胞分选 | FACS Melody流式细胞分选仪 | BD | -- |
| 信号传导实验 | 蛋白酶抑制剂 | Sigma | 11836153001 |
| 磷酸酶抑制剂 | Sigma | 4906837001 | |
| 重组EphA7蛋白 | Sino Biological | 11657-H08H | |
| 重组EphB1蛋白 | Sino Biological | 11963-H08H | |
| 免疫印迹 | 抗FLAG M2磁珠 | Thermo Fisher Scientific | A36797 |
| 4x LDS上样缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| 硝酸纤维素膜 | Biorad | -- | |
| 化学发光底物 | Millipore | WBLUR0500 | |
| 流式细胞术 | Zombie yellow活力染料 | BioLegend | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| FlowJo v10软件 | -- | -- | |
| PE标记试剂盒 | ThermoFisher Scientific | S10467 | |
| 结合动力学 | LILRB5胞外域-Fc融合蛋白 | R&D Systems | 10410-T4 |
| Protein A生物传感器 | Sartorius | 18-5010 | |
| 动力学缓冲液 | Sartorius | 18-1105 | |
| 报告细胞实验 | 人IgG对照抗体 | -- | -- |
| 巨噬细胞极化 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Sino Biological | 11792-H08H-20 |
| 人白细胞介素-4 | Sino Biological | 11846-HNAE-1 | |
| 脂多糖 | Sigma | L4516 | |
| ELISA | 人IL-8 ELISA MAX Deluxe试剂盒 | BioLegend | 431504 |
| 96孔板酶标仪 | BioTek | Synergy LX | |
| 细胞增殖 | CellTiter 96 AQueous One Solution试剂 | Promega | G3582 |
| 肿瘤实验 | 抗CD4抗体 | Bioxcell | BE0003-3 |
| 抗CD8抗体 | Bioxcell | BE0117 | |
| 同型对照抗体 | Bioxcell | BE0089, BE0090 | |
| 脱氧核糖核酸酶 | -- | -- | |
| 胶原酶 | -- | -- | |
| 70微米细胞筛网 | Fisherbrand | 22363548 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外结合实验 | Eph受体蛋白的浓度（如20 μg/mL）、LILRB5蛋白的浓度、细胞表面表达验证 阅读提示：看Figure 1的相关方法和图注 |
| 信号传导实验 | 共培养时间（30分钟）、384孔板中蛋白包被、抗体浓度（20 μg/mL）、细胞密度（1×10^6） 阅读提示：Materials and Methods中的“293T reconstituted signaling”和“THP1-LILRB5 signaling” |
| 体外功能实验 | 重组Eph蛋白浓度（10 μg/mL）、抗体浓度（20 μg/mL）、刺激时间（48小时）、细胞类型（THP-1-LILRB5、MDSC） 阅读提示：Materials and Methods中的“M2 macrophage polarization”和Figure 5的图注 |
| 体内肿瘤模型 | 肿瘤细胞注射数量（5×10^5）、抗体剂量（200 μg）、给药频率（每周两次）、肿瘤测量时间点、小鼠品系和性别匹配 阅读提示：Materials and Methods中的“Tumor experiments in LILRB5-transgenic mice” |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号、染色浓度、孵育时间（至少30分钟）、死细胞排除染料（Zombie yellow或PI）、仪器设置 阅读提示：Materials and Methods中的“Flow cytometry”和Supplementary Table S1 |