化合物设计与合成
基于Val70Ub位点设计喹啉类PLpro抑制剂并合成系列类似物。
通过结构导向设计，合成系列喹啉类似物，并在FRET酶学实验和细胞毒性实验中测试。
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喹啉类SARS-CoV-2木瓜蛋白酶样抑制剂作为口服抗病毒候选药物的设计
Design of quinoline SARS-CoV-2 papain-like protease inhibitors as oral antiviral drug candidates.
实验完整度
高包含酶学抑制、细胞抗病毒、X射线晶体结构、体内药代及小鼠感染模型等多层级验证。
主要模型
Vero E6细胞 Caco-2-ACE2-TMPRSS2细胞 Vero-ACE2-TMPRSS2细胞 BALB/c小鼠SARS2-N501YMA30感染模型
重点核对
Jun13296的酶学抑制活性（IC50=0.13 µM, Ki=8.8 nM） Jun13296的抗病毒活性（EC50=0.1 µM） Jun13296在小鼠中的口服生物利用度32.8% 125 mg/kg BID-3给药方案在小鼠感染模型中的保护效果
摘要
不断演变的SARS-CoV-2变异株需要开发额外的口服抗病毒药物。本研究展示了含喹啉的SARS-CoV-2木瓜蛋白酶样（PLpro）抑制剂作为潜在口服抗病毒候选药物的系统设计。通过利用最近发现的PLpro中的Val70Ub结合位点，我们设计了一系列喹啉类似物，显示出有效的PLpro抑制和抗病毒活性。值得注意的是，6个先导化合物的X射线晶体结构显示，2-芳基取代可以如预期占据Val70Ub位点，或以翻转方向占据BL2沟槽。体内先导化合物Jun13296表现出良好的药代动力学特性，并对SARS-CoV-2变异株和耐尼马瑞韦突变株具有强效抑制作用。在SARS-CoV-2感染的小鼠模型中，口服Jun13296可显著提高存活率、减少体重下降和肺病毒滴度，并防止肺组织损伤。这些结果强调了喹啉类PLpro抑制剂作为有前景的口服SARS-CoV-2抗病毒候选药物的潜力，为SARS-CoV-2治疗的未来带来了希望。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 设计并评估喹啉类SARS-CoV-2 PLpro抑制剂作为口服抗病毒候选药物的潜力。
- 核心机制
- Jun13296通过占据Val70Ub位点和BL2沟槽，抑制PLpro的蛋白酶、去泛素化和去ISG化活性。
- 主要证据
- X射线晶体结构显示Jun13296结合于Val70Ub位点；酶学实验显示抑制PLpro水解底物；小鼠感染模型中口服Jun13296提高生存率并降低肺病毒滴度。
- 研究意义
- Jun13296作为有前景的口服SARS-CoV-2抗病毒候选药物，为抗击COVID-19提供了新的治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外活性筛选
评估化合物的酶学抑制活性和抗病毒活性。
通过FRET酶学实验、FlipGFP细胞实验和SARS-CoV-2抗病毒实验测试化合物的活性。
体内药代动力学研究
评估候选化合物的口服药代动力学特性。
对八个化合物进行口服给药，测量血浆药物浓度，并选择Jun13296进行24小时PK研究。
机制研究
阐明Jun13296的抑制机制和选择性。
通过DSF、酶学实验和宿主蛋白酶面板测试Jun13296的机理和选择性。
结构生物学研究
确定PLpro与抑制剂复合物的晶体结构，揭示结合模式。
解析六个抑制剂复合物的晶体结构，显示结合模式。
广谱抗病毒活性评估
评估Jun13296对SARS-CoV-2变异株和耐尼马瑞韦突变株的活性。
使用空斑实验测试Jun13296对SARS-CoV-2 WA1、XBB1.16、JN.1及耐药株的抑制活性。
体内抗病毒药效评估
评估Jun13296在小鼠感染模型中的保护效果。
使用致死性SARS-CoV-2小鼠模型，口服给药Jun13296或Jun12682，监测生存率、体重、肺病毒滴度、组织病理和细胞因子表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 10013CM |
| 胎牛血清 | Gibco | 10-438-026 | |
| 青霉素/链霉素 | -- | 30-001-CI | |
| 非必需氨基酸 | Cytiva HyClone | SH30238.01 | |
| 嘌呤霉素 | InVivogen | ant-pr-1 | |
| 杀稻瘟菌素 | InVivogen | ant-bl-05 | |
| 蛋白表达 | 异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷 | -- | -- |
| 蛋白纯化 | 镍-次氮基三乙酸树脂 | Qiagen | -- |
| TEV蛋白酶 | -- | -- | |
| Amicon Ultra-15超滤膜 | Millipore | -- | |
| 结晶 | Oryx8结晶机器人 | Douglas Instruments Ltd | -- |
| Intelli-Plate结晶板 | Art Robbins Instruments | -- | |
| 衍射数据收集 | Pilatus 6M探测器 | Dectris | -- |
| Eiger 9M探测器 | Dectris | -- | |
| DSF实验 | SYPRO橙 | Invitrogen | S6650 |
| 酶学实验 | 泛素-AMC底物 | UBPBIO | M3010 |
| ISG15-AMC底物 | R&D | UL-553 | |
| USP14酶 | ProSci | 91-171 | |
| USP7酶 | Sino Biological | 11681-H20B | |
| FlipGFP实验 | pcDNA3-TEV-flipGFP-T2A-mCherry质粒 | Addgene | 124429 |
| pcDNA3.1 SARS2 PLpro质粒 | Genscript | -- | |
| transIT-293转染试剂 | Mirus | -- | |
| 酶学实验 | USP2酶 | R&D systems | E504 |
| USP8酶 | Boston Biochem | E-520-025 | |
| USP15酶 | R&D systems | E594 | |
| USP30酶 | R&D systems | E582 | |
| UCH-L1酶 | R&D systems | 6007-CY | |
| 组织蛋白酶B | Calbiochem | -- | |
| 组织蛋白酶K | -- | -- | |
| 钙蛋白酶-1 | Sigma | C6108 | |
| 半胱天冬酶-3 | BioVision | 1083 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma | T6763 | |
| 抗病毒实验 | Nano-Glo荧光素酶实验 | Promega | G9243 |
| Avicel微晶纤维素 | FMC polymers | -- | |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 动物实验 | 0.5%甲基纤维素 | -- | -- |
| 吐温80 | -- | -- | |
| 喂食管 | Instech | FTP203050 | |
| 组织处理 | 锌缓冲福尔马林 | Fisher Scientific | STLBFZ1 |
| Tissue-Tek VIP 6 AI组织处理机 | Sakura Finetek | -- | |
| Paraplast石蜡 | Leica | -- | |
| VistaVision HistoBond玻片 | VWR | -- | |
| 免疫组化 | 柠檬酸抗原修复液 | Vector Laboratories | H-3300 |
| SARS-CoV-2核衣壳抗体 | Genetex | GTX635686 | |
| VECTASTAIN Elite ABC-HRP试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| RT-qPCR | RT² HT第一链合成试剂盒 | QIAGEN | 330411 |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Fisher | A25918 | |
| QuantStudio 6 Pro实时PCR系统 | ThermoFisher | A43160 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 化合物合成 | 合成步骤和表征数据见补充方法。 阅读提示：补充图6-8，补充方法 |
| 酶学实验 | PLpro浓度、底物浓度、反应缓冲液、Ki计算使用Morrison方程。 阅读提示：Methods: Enzymatic assays |
| 抗病毒实验 | 细胞系（Caco-2-AT, Vero-AT）、MOI、化合物浓度范围（3倍稀释，起始30 µM或10 µM）、CP-100356浓度2 µM。 阅读提示：Methods: Antiviral assays with live SARS-CoV-2 |
| 小鼠体内药效实验 | 小鼠品系（BALB/c,雌性）、年龄（9-12周龄）、病毒（SARS2-N501YMA30, 6000 PFU）、给药剂量（125 mg/kg或75 mg/kg）、给药频率（BID，间隔10-14小时，持续3天）、终点（体重下降20%处死）。 阅读提示：Methods: Mouse experiments, 图7a |
| 药代动力学研究 | 小鼠品系（C57BL/6J, 雄性）、剂量（口服50 mg/kg，静脉10 mg/kg）、取样时间点（0.5,1,3,5小时；24小时研究）、LC-MS/MS测定。 阅读提示：Methods: 体内PK研究（图3） |