重组人HMGB1的表达与纯化
获得高纯度且有功能的重组HMGB1蛋白用于细胞刺激实验
将人HMGB1克隆至修饰的pET-22b(+)载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，通过Ni-NTA和肝素Sepharose两步亲和层析纯化，SDS-PAGE验证纯度，最终产量为每升细菌培养4.95 mg。
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树枝状聚甘油硫酸盐通过抑制RAW 264.7巨噬细胞中的HMGB1/RAGE轴减轻炎症
Dendritic Polyglycerol Sulfate Reduces Inflammation Through Inhibition of the HMGB1/RAGE Axis in RAW 264.7 Macrophages.
实验完整度
高研究包含体外细胞模型（RAW 264.7巨噬细胞、HMC3小胶质细胞），涉及蛋白表达纯化、PLA、NF-κB转位、基因表达、蛋白分泌、NO检测、细胞摄取及EPR机制验证，具备两个以上独立证据层级和明确功能验证。
主要模型
RAW 264.7小鼠巨噬细胞 HMC3人小胶质细胞 重组人HMGB1蛋白
重点核对
RAW 264.7巨噬细胞在无血清条件下处理24小时，LPS浓度100 ng/mL，dPGS浓度50 nM NF-κB转位实验：HMGB1 1 µg/mL、LPS 100 ng/mL、dPGS 50 nM处理90分钟 RT-PCR和RT-qPCR检测TNF-α、IL-6、MCP-1、COX-2、iNOS mRNA表达 ELISA检测TNF-α分泌，处理时间为16小时 EPR分析HMGB1/sRAGE/dPGS复合物，使用MTSL标记HMGB1的Cys106
摘要
高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是从受损或应激细胞释放的核心促炎介质，它激活晚期糖基化终末产物受体（RAGE）等受体。树枝状聚甘油硫酸盐（dPGS）是一种超支化聚阴离子聚合物，以其抗炎活性而闻名。在本研究中，我们考察了dPGS如何调节RAW 264.7巨噬细胞和人小胶质细胞中HMGB1驱动的信号传导。在大肠杆菌（E. coli）中表达的重组人HMGB1通过镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）和肝素层析纯化。邻近连接实验（PLA）显示，dPGS显著破坏HMGB1/RAGE相互作用，特别是在脂多糖（LPS）刺激下，从而减少炎症信号复合物的形成。这与核因子κB（NF-κB）通路活化的减少相关，表现为核转位和转录活性的降低。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和定量实时PCR（RT-qPCR）显示，dPGS抑制HMGB1和LPS诱导的肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、环氧合酶-2（COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的转录。酶联免疫吸附测定（ELISA）和Griess实验确认了TNF-α分泌和一氧化氮产生的减少。电子顺磁共振（EPR）波谱进一步表明，dPGS改变了HMGB1/可溶性RAGE（sRAGE）复合物的动力学，为其受体破坏作用提供了机制见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- dPGS能否抑制HMGB1/RAGE轴介导的炎症信号通路，从而减少炎症反应？
- 核心机制
- dPGS通过破坏HMGB1/RAGE相互作用，抑制NF-κB核转位和转录活性，减少促炎细胞因子和介质的表达，并可能形成三元复合物改变受体-配体组装。
- 主要证据
- PLA显示dPGS显著减少LPS刺激下HMGB1/RAGE复合物形成；NF-κB转位实验显示dPGS降低核内NF-κB信号；RT-PCR和RT-qPCR显示dPGS抑制TNF-α、IL-6、MCP-1、COX-2和iNOS的mRNA水平；ELISA和Griess实验显示TNF-α和NO分泌减少；EPR证实dPGS与HMGB1/sRAGE复合物相互作用。
- 研究意义
- dPGS在胞外和胞内水平抑制HMGB1/RAGE信号传导，具有作为减轻HMGB1或LPS驱动的炎症过程的多功能治疗剂的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HMGB1/RAGE相互作用检测
评估dPGS对HMGB1与RAGE结合的影响
使用PLA（邻近连接实验）检测RAW 264.7巨噬细胞和HMC3小胶质细胞中HMGB1/RAGE复合物的形成，在LPS和/或dPGS处理后进行。
NF-κB核转位分析
检测dPGS是否抑制HMGB1或LPS诱导的NF-κB激活与核转位
通过免疫荧光显微镜观察NF-κB p65在RAW 264.7巨噬细胞中的定位，量化核内平均荧光强度，并比较不同处理组的差异。
炎症基因表达分析
评估dPGS对HMGB1或LPS诱导的促炎细胞因子和介质mRNA表达的影响
通过RT-PCR和RT-qPCR检测TNF-α、IL-6、MCP-1、COX-2和iNOS的mRNA水平，以β-actin作为内参基因。
TNF-α和NO分泌检测
验证dPGS在蛋白水平上对HMGB1或LPS诱导的TNF-α和NO分泌的影响
通过ELISA检测细胞培养上清中的TNF-α浓度，使用Griess试剂检测NO（以亚硝酸盐形式）产生，并进行MTT实验评估细胞活性。
dPGS-Cy5摄取动力学分析
研究dPGS在巨噬细胞中的摄取时间进程及HMGB1或LPS对其摄取的影响
使用流式细胞术检测Cy5标记的dPGS在RAW 264.7巨噬细胞中的摄取情况，在不同时间点（1、6、16、24小时）测量荧光强度，并比较单独dPGS或与HMGB1/LPS共处理时的差异。
EPR光谱分析HMGB1/sRAGE/dPGS相互作用
在分子水平上阐明dPGS与HMGB1及sRAGE的相互作用模式
使用MTSL标记HMGB1的Cys106残基，通过cw-EPR光谱分析HMGB1单独、与sRAGE结合、以及与sRAGE和dPGS三元复合物的光谱特征，比较2Azz值变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | pET-22b(+)载体 | Merck | -- |
| Q5高保真2x预混液 | New England Biolabs | -- | |
| Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| NucleoSpin质粒提取试剂盒 | Macherey-Nagel | -- | |
| 溶菌酶 | Roche Diagnostics | -- | |
| Benzonase核酸酶 | Merck | -- | |
| 不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| HisTrap FF柱 | Cytiva | -- | |
| HiTrap肝素Sepharose FF柱 | Cytiva | -- | |
| Amicon超滤管（3 kDa截留） | Merck | -- | |
| 蛋白分析 | Instant Blue考马斯蛋白染液ISB1L | Abcam | -- |
| 预染蛋白分子量标准10-180 kDa | Thermo Fisher | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| DPBS缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 台盼蓝 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Luna FL双荧光细胞计数仪 | Logos Biosystems | -- | |
| 25 cm²培养瓶 | Corning | -- | |
| 细胞处理 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 重组人HMGB1 | -- | -- | |
| 树枝状聚甘油硫酸盐 | -- | -- | |
| Cy5标记的dPGS | -- | -- | |
| 多粘菌素B | -- | -- | |
| PLA实验 | Duolink In Situ橙色起始试剂盒（山羊/兔） | Millipore-Sigma | -- |
| Duolink In Situ红色起始试剂盒（小鼠/兔） | Millipore-Sigma | -- | |
| 鬼笔环肽-iFluor 488 | Abcam | -- | |
| 鬼笔环肽Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Hoechst 33342三盐酸盐 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 山羊抗人RAGE抗体 | Biotechne | -- | |
| 兔抗人HMGB1抗体 | Abcam | -- | |
| 兔抗人RAGE抗体 | Abcam | -- | |
| 小鼠抗人HMGB1 [1F3]抗体 | Abcam | -- | |
| 多聚-L-赖氨酸 | Corning | -- | |
| 免疫荧光 | NF-κB p65 (D12E12) XP兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| 山羊抗兔IgG (H+L)交叉吸附二抗，FITC标记 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 正常山羊血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Epredia Immu-Mount封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RT-PCR | 一步法RT-PCR试剂盒 | Qiagen | -- |
| NucleoSpin RNA小量提取试剂盒 | Macherey-Nagel | -- | |
| Gene Ruler 100 bp DNA分子量标准 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| iScript select cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| SSO advanced SYBR Green super mix | Bio-Rad | -- | |
| CFX Opus实时PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| NO检测 | Griess试剂盒 | Promega | -- |
| ELISA | 小鼠TNF-α DuoSet试剂盒 | Bio-Techne | -- |
| DuoSet辅助试剂盒2 | Bio-Techne | -- | |
| MTT实验 | MTT | Merck | -- |
| 二甲基亚砜 | Merck | -- | |
| 流式细胞术 | 流式细胞术缓冲液 | -- | -- |
| Attune NxT声波聚焦流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EPR | 重组人RAGE蛋白（His标签） | Sino Biological | 11629-H08H |
| MTSL | TRC | -- | |
| Amicon Ultra超滤管（3 kDa） | Merck Millipore | -- | |
| Bruker BR420 X波段波谱仪 | Bruker | -- | |
| 显微镜 | Zeiss Axio Observer Z1显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| Leica DMI4000 B显微镜 | Leica | -- | |
| 蛋白浓度测定 | NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 凝胶成像 | ChemiDoc MP凝胶成像系统 | BioRad | -- |
| 离心 | Centrifuge 5425 R离心机 | Eppendorf | -- |
| 超声破碎 | Branson Sonifier 250超声破碎仪 | -- | -- |
| 蛋白纯化系统 | Äkta pure 25蛋白质纯化系统 | Cytiva | -- |
| PCR | PCR 2720热循环仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源及培养条件：RAW 264.7 (ATCC TIB-71)，HMC3 (ATCC CRL-3304)；培养基成分（DMEM、FBS浓度、青霉素-链霉素）；培养温度（37°C）、CO₂浓度（5%）；传代比例（1:3-1:8） 阅读提示：Methods 4.6 和 4.7 |
| PLA实验 | 细胞密度（RAW 264.7: 10,000 cells/coverslip；HMC3: 7000 cells/coverslip）；处理条件（100 ng/mL LPS，50 nM dPGS，血清-free，24小时）；抗体使用（抗RAGE、抗HMGB1克隆及稀释度） 阅读提示：Methods 4.8 |
| NF-κB转位实验 | 处理浓度（1 µg/mL HMGB1，100 ng/mL LPS，50 nM dPGS）；处理时间（90分钟）；一抗（NF-κB p65 D12E12，1:400）；二抗（FITC标记，1:750） 阅读提示：Methods 4.9 |
| RT-PCR | 细胞密度（3×10⁵ cells/well）；处理浓度和时间（1 µg/mL HMGB1或100 ng/mL LPS ± 50 nM dPGS，6小时）；RNA提取试剂盒（NucleoSpin RNA Mini Kit）；RT-PCR试剂盒（One-Step RT-PCR Kit，250 ng RNA）；引物序列（见表1）；退火温度（TNF-α/ACTB 56°C，IL-6/MCP-1 59°C） 阅读提示：Methods 4.10，Table 1 |
| RT-qPCR | 细胞密度（1×10⁶ cells/well）；处理条件（100 ng/mL LPS ± 1.6 µM dPGS，48小时）；RNA提取（RNeasy kit）；cDNA合成（iScript select kit，100 ng RNA）；qPCR试剂（SSO advance Syber green super mix）；定量方法（2⁻ΔΔCt，β-actin内参） 阅读提示：Methods 4.11 |
| ELISA | 细胞密度（10,000 cells/well，96-well板）；处理条件（1 µg/mL HMGB1或100 ng/mL LPS ± dPGS，16小时）；ELISA试剂盒（mouse DuoSet for TNF-α） 阅读提示：Methods 4.13 |
| NO实验 | 细胞密度（1×10⁵ cells/well）；处理条件（100 ng/mL LPS ± dPGS（0-25.6 µM），24小时）；Griess试剂盒（Promega）；检测波长（570 nm） 阅读提示：Methods 4.12 |
| dPGS-Cy5摄取实验 | 细胞密度（1×10⁵ cells/well，24-well板）；dPGS-Cy5浓度（50 nM）；处理时间（1、6、16、24小时）；流式细胞仪设置（Attune NxT，RL1通道，激发638 nm，670/14 nm带通）；检测细胞数（10,000单细胞/样本） 阅读提示：Methods 4.15 |
| EPR实验 | 蛋白浓度（HMGB1 11 µM，sRAGE 2 µM，dPGS 4 µM）；缓冲液成分（150 mM NaCl, 25 mM HEPES, pH 7.0）；自旋标记方法（MTSL标记Cys106，4°C孵育24小时）；波谱仪参数（Bruker BR420，调制频率100 kHz，调制振幅3 G，功率5 mW） 阅读提示：Methods 4.16 |
| 统计分析 | 统计方法（one-way或two-way ANOVA，事后检验Tukey's, Dunnett's, 或Tukey-Kramer）；显著性水平（p < 0.05）；重复次数（至少三次独立实验） 阅读提示：Methods 4.17 |