单域抗体的分离与筛选
获得靶向乙型流感病毒HA和NA保守区域的单域抗体。
使用编码10种HA或NA的DNA混合物免疫骆驼，构建噬菌体展示文库，通过生物淘选富集特异性VHH，并筛选具有中和活性的克隆。
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靶向血凝素和神经氨酸酶的单域抗体可预防乙型流感病毒感染
Single-domain antibodies directed against hemagglutinin and neuraminidase protect against influenza B viruses.
实验完整度
高包含体外中和实验、多聚体形成实验、酶活性抑制实验、冷冻电镜结构解析、动物攻毒保护实验等多个独立证据层级，且涵盖功能与机制验证。
主要模型
MDCK细胞 HeLa细胞 雌性DBA/2J小鼠 人类IgG1-Fc融合单域抗体
重点核对
VHH-69和VHH-75的CDR3序列 hVHH-69中E64位点突变为K导致结合受损 hVHH-504和hVHH-525对NA E117A突变病毒的敏感性 hVHH-525与NA活性位点的结合 VHH-Fc融合蛋白的体内保护剂量
摘要
乙型流感病毒具有抗原多样性，且对每年的流感负担有显著贡献。在此，我们报道了靶向血凝素和神经氨酸酶高度保守区域的乙型流感病毒中和单域抗体。通过单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）的结构研究揭示，其中一种单域抗体通过靶向血凝素茎部区域跨越两个原体的四聚表位，阻止病毒血凝素向融合后状态的构象转变。第二种单域抗体广泛抑制乙型流感病毒神经氨酸酶活性，包括对奥司他韦耐药的神经氨酸酶，其与神经氨酸酶的复合物通过单颗粒cryo-EM解析，确定其结合于神经氨酸酶催化位点的残基。这些单域抗体的头尾融合产生了双特异性结合分子，进一步提高了对乙型流感病毒的中和广度和效力。这些单域抗体与人IgG1-Fc结构域融合后，完全保护雌性小鼠免受致死性乙型流感病毒的攻击。我们的发现强调了工程化单域抗体在帮助控制乙型流感病毒感染方面的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发出靶向乙型流感病毒HA和NA保守区域的单域抗体，并评估其中和活性及体内保护效果？
- 核心机制
- hVHH-69通过结合HA茎部四聚表位，阻止低pH诱导的HA构象转变，从而抑制膜融合；hVHH-525通过结合NA活性位点，抑制神经氨酸酶活性，阻断病毒释放。
- 主要证据
- 通过cryo-EM解析了hVHH-69与HA、hVHH-525与NA的复合物结构；体外中和实验显示交叉谱系中和活性；小鼠攻毒实验显示Fc融合蛋白完全保护小鼠。
- 研究意义
- 研究表明工程化VHH及其Fc融合蛋白有望作为广谱预防乙型流感病毒感染的候选药物，尤其可能对免疫受损患者有益。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
hVHH-69和hVHH-75的功能验证
验证hVHH-69和hVHH-75对HA介导的膜融合的抑制作用及机制。
通过蛋白酶敏感性实验、多核体形成实验验证hVHH-69和hVHH-75阻止低pH诱导的HA构象变化，并通过cryo-EM解析hVHH-69与HA的复合物结构。
hVHH-504和hVHH-525的功能验证
验证hVHH-504和hVHH-525对NA酶活性的抑制作用及机制。
通过MUNANA实验检测NA活性抑制，通过病毒释放抑制实验验证对病毒释放的干扰，并通过cryo-EM解析hVHH-525与NA的复合物结构。
工程化抗体格式优化
提高抗体的中和活性和广谱性。
通过头尾融合构建同源二聚体、异源二聚体及Fc融合蛋白，并评估其中和活性和Fc效应功能。
体内保护效果评估
评估VHH-Fc融合蛋白对致死性乙型流感病毒攻击的小鼠的保护效果。
在雌性DBA/2J小鼠中，通过腹腔注射或鼻内给药，评估VHH-Fc融合蛋白的预防效果，记录生存率和体重变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA免疫 | pCAXL载体 | New England Biolabs | E2611 |
| 质粒提取 | 无内毒素大提质粒试剂盒 | Qiagen | 12381 |
| 细胞培养 | TPCK处理的胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T1426 |
| 蛋白质表达 | Expi293瞬时表达系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白质纯化 | StrepTrap-HP柱 | Cytiva | -- |
| D-脱硫生物素 | Sigma-Aldrich | D1411 | |
| 蛋白质分析 | 全蓝蛋白质标准品 | Bio-Rad | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 细胞染色 | DAPI | Invitrogen | D1306 |
| ELISA | TMB底物 | BD OptEIA | -- |
| iMark酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| NA酶活性检测 | MUNANA底物 | Merck | M8639 |
| 抗病毒药物 | 扎那米韦 | Sigma-Aldrich | SML0492 |
| 帕拉米韦 | Merck | SML2486 | |
| 拉尼米韦 | MedChemExpress | R125489 | |
| Western blot | 抗乙型流感病毒HA抗体 | Sino Biological | 11053-RP01 |
| 抗小鼠IgG HRP偶联抗体 | GE Healthcare | NA931V | |
| Pierce ECL蛋白质印迹底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | 抗His标签抗体 | Genscript | A00186 |
| NovoCyte Quanteon流式细胞仪 | Agilent | -- | |
| BLI | Octet RED96 | FortéBio | -- |
| 链霉亲和素生物传感器 | FortéBio | -- | |
| ADCC报告基因 | Quanti-Luc | InvivoGen | rep-qlc4lg1 |
| Infinite 200 Pro Tecan读板器 | Tecan Life Science | -- | |
| 蛋白质纯化 | MabSelect SuRe柱 | GE Healthcare | -- |
| HiPrep脱盐柱 | Cytiva | -- | |
| cryo-EM | Quantifoil R2/1网格 | Quantifoil Micro Tools GmbH | -- |
| K3直接探测器 | Gatan | -- | |
| JEOL cryoARM 300显微镜 | JEOL | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| VHH分离与筛选 | 免疫质粒数量、免疫时间、噬菌体文库构建、淘选次数及病毒株 阅读提示：Methods：Llama immunization and seroconversion、Library generation、Phage isolation |
| hVHH功能验证 | hVHH浓度、孵育时间、pH值、细胞类型、病毒株 阅读提示：Methods：Inhibition of HA proteolytic maturation、HA protease sensitivity assay、Polykaryon assay |
| NA酶活性抑制 | hVHH与NA的摩尔比、孵育时间、底物浓度 阅读提示：Methods：MUNANA assay |
| 结构与机制研究 | cryo-EM参数（如电压、总剂量、像素大小）、对称性、模型构建 阅读提示：Methods：Electron cryo-Microscopy、Cryo-EM image processing、Cryo-EM model Building |
| 体内保护实验 | 小鼠品系、性别、攻毒剂量、给药途径、给药时间、剂量、样本量 阅读提示：Methods：Mice、Figure 6 legend |