抗原制备与纳米抗体文库构建
获得高纯度RSV F蛋白并免疫骆驼以构建纳米抗体文库。
将RSV（A2株）F蛋白基因克隆至PTT5载体，在HEK 293F细胞中瞬时表达，经Ni-NTA纯化获得高纯度F蛋白；以0.5 mg/次免疫单峰骆驼四次，经ELISA检测血清效价；分离PBMC，提取RNA，逆转录为cDNA，PCR扩增VHH片段，克隆至噬菌粒载体，构建纳米抗体噬菌体展示文库。
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针对呼吸道合胞病毒F蛋白纳米抗体的生成及间接免疫荧光检测方法的建立
Generation of nanobodies against the F protein of respiratory syncytial virus and establishment of an indirect immunofluorescence assay.
实验完整度
高包含体外细胞模型、动物模型和多种功能验证，如ELISA、Western blot、流式、IHC、IF，以及中和实验。
摘要
呼吸道合胞病毒（RSV）感染是儿童和老年人急性呼吸道感染和死亡的主要原因。目前，市场上缺乏有效的疫苗和抗体治疗，且RSV的临床表现与其他病原体引起的急性呼吸道感染难以区分。因此，RSV的预防和治疗不仅需要有效的疫苗，还需要简单、快速、经济有效的检测和诊断方法。鉴于纳米抗体分子量小、抗原结合特异性和亲和力优异，我们通过表达RSV F蛋白、免疫骆驼并建立噬菌体展示文库，成功获得了一系列纳米抗体。其中，F-E2已被证明能特异性结合RSV F蛋白，可用于Western blot、酶联免疫吸附试验、流式细胞术、免疫组织化学和免疫荧光试验。此外，基于F-E2的RSV免疫荧光检测方法已建立，并证明其具有高度特异性、敏感性、经济性和快速性，具有巨大的应用潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何获得针对RSV F蛋白的纳米抗体并建立简单、快速、经济有效的RSV检测方法？
- 核心机制
- 纳米抗体F-E2特异性结合RSV F蛋白的抗原表位IV，基于此建立基于免疫荧光的RSV滴度检测和中和抗体效价测定方法。
- 主要证据
- 通过噬菌体展示文库筛选出F-E2，ELISA显示其结合亲和力（EC50）为纳克级别，竞争性ELISA表明其结合位点IV；免疫荧光检测对RSV A2、B株和临床分离株具有特异性，并可检测中和抗体效价。
- 研究意义
- 该检测方法有望用于RSV感染的早期识别、中和抗体筛选和治疗药物评估，为RSV感染检测试剂的开发提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
纳米抗体的筛选与表达
从噬菌体展示文库中筛选出特异性结合RSV F的纳米抗体。
使用F蛋白进行两轮panning，获得克隆库，通过单克隆噬菌体ELISA筛选阳性克隆，测序后选取7个候选纳米抗体；将其构建为Nb-TEV-Fc融合蛋白，经Protein A柱纯化，用SDS-PAGE验证纯度。
候选纳米抗体亲和力及表位分析
评估候选纳米抗体与RSV F的结合亲和力并确定其抗原表位。
通过ELISA测定候选抗体的EC50值；通过竞争性ELISA与已知表位抗体（131-2a、palivizumab、MPE8、101F、hRSV90、MEDI-8897）竞争，确定F-E2结合表位IV。
间接免疫荧光检测方法的建立与优化
建立基于F-E2的RSV免疫荧光检测方法并优化其灵敏度和特异性。
使用F-E2-Fc或F-E2-His作为一抗，对感染RSV的Vero细胞进行免疫荧光染色，评估对不同RSV株的检测能力；确定最佳工作浓度（10 ng/mL）；用不同呼吸道病毒（RSV、SARS-CoV-2 Omicron JN.1、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63）验证特异性；通过梯度稀释病毒测试灵敏度。
中和抗体效价检测方法的建立
验证F-E2在RSV中和试验中检测中和抗体的适用性。
以palivizumab和nirsevimab作为阳性对照，用间接免疫荧光法检测其中和RSV A2的效价，计算IC50；并用该方法评估扶正解毒方对RSV的抑制作用。
F-E2的多用途验证
验证F-E2在多种检测方法中的适用性，包括流式细胞术、Western blot和免疫组织化学。
用F-E2作为一抗进行流式细胞术检测RSV感染细胞；Western blot检测RSV F蛋白线性表位；免疫组化检测RSV感染小鼠肺组织中的F蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Vero细胞 | BDBIO | C5168 |
| DMEM培养基 | VivaCell | C3103-0500 | |
| 胎牛血清 | VivaCell | BL201A | |
| 青霉素-链霉素 | Biosharp | BL505A | |
| 蛋白表达 | 聚乙烯亚胺 | MACKLIN | P924174-1g |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA亲和层析柱 | Bioworks | -- |
| HiTrap Protein A层析柱 | Cytiva | 17040301 | |
| Amicon Ultra超滤离心管 | Merck KGaA | -- | |
| 蛋白浓度测定 | NanoDrop One分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 筛选 | 96孔微孔板 | Beijing Yunpeptide Biotechnology | 100096H |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| HRP标记的山羊抗人IgG (H+L) | Proteintech | SA00001-17 | |
| 超灵敏ECL化学发光液 | P&Q Science Technology | -- | |
| ELISA | 兔抗人IgG-Fc HRP | Sino Biological | 10702-T16-H-100 |
| TMB底物溶液 | Beyotime | P0209 | |
| Multiskan FC酶标仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | FITC标记的山羊抗人IgG | Proteintech | SA00003-12 |
| CytoFLEX流式细胞仪 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 异氟烷 | -- | -- |
| 二抗（Zsbio，#PV-6000） | Zsbio | PV-6000 | |
| DAB显色液 | Zsbio | ZLI-9018 | |
| Nikon Eclipse 50i显微镜 | Nikon | -- | |
| 免疫荧光 | ImageXpress MicroConfocal显微镜 | Moleculardevices | 76177-140 |
| 蛋白纯化 | 微量蛋白纯化系统 | Union-Biotech | UEV |
| 蛋白样品处理 | 2× SDS上样缓冲液 | TANON | 180-8210D |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与病毒扩增 | Vero细胞培养条件（DMEM、10% FBS、1%青霉素-链霉素）、RSV感染后收获时间（5-7天） 阅读提示：Materials and Methods, Cells and viruses |
| 抗原制备 | HEK 293F细胞转染条件（PEI、37°C、120 rpm、5% CO2、培养4天） 阅读提示：Materials and Methods, Construction, expression, and purification of RSV (strain A2) F proteins |
| 纳米抗体文库构建 | 免疫剂量（0.5 mg/次，共4次）、血清效价标准（OD450=0.1时稀释度>10000） 阅读提示：Results, Antigen production, immunizing camel, and building library |
| 间接免疫荧光检测 | F-E2工作浓度（10 ng/mL）、病毒稀释梯度、感染时间（1 h后换液，培养48 h） 阅读提示：Materials and Methods, Indirect immunofluorescence assay; Results, Establishment and optimization of an indirect immunofluorescence assay |