生成hiPSC来源的原始巨噬细胞
验证能否从人iPSC分化获得具有原始巨噬细胞特征的细胞。
通过优化细胞因子鸡尾酒诱导hiPSC形成EB，经BMP4、bFGF、Activin A诱导中胚层，BMP4、bFGF、VEGF诱导生血内皮，再用M-CSF、IL-3产生髓系祖细胞，最后用M-CSF、bFGF成熟为巨噬细胞（CD11b+CD14+）。
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来自人iPSC来源的原始巨噬细胞的条件培养基促进成体心肌细胞增殖和心脏再生
Medium from human iPSC-derived primitive macrophages promotes adult cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration.
实验完整度
高从细胞分化、共培养、条件培养基处理、蛋白质组学、通路验证到动物模型（非损伤及I/R损伤）进行多层级验证，包含体外和体内功能及机制研究。
主要模型
人iPSC来源的心肌细胞（hiPSC-CMs） 人iPSC来源的原始巨噬细胞（hiPMs） C57BL/6J小鼠（心肌缺血再灌注损伤模型） MADM小鼠（心肌细胞分裂追踪模型）
重点核对
hiPM-cm制备：hiPMs在RPMI+B27培养基中孵育48小时收集上清 体内注射剂量：单次心肌内注射40μL hiPM-cm I/R手术：左前降支冠状动脉结扎40分钟后松开再灌注 细胞增殖检测：Ki67、pHH3、Aurora B免疫荧光染色 信号通路验证：AKT、ERK、STAT3磷酸化及相应抑制剂处理
摘要
心脏损伤的特征是构成心脏收缩组织的心肌细胞不可逆丧失，因此，能够促进成体心肌细胞增殖的策略对于治疗各种心脏病具有很高的需求。在此，我们测试了人诱导多能干细胞来源的原始巨噬细胞（hiPMs）及其条件培养基（hiPM-cm）促进人心肌细胞增殖和增强成体小鼠心脏再生的能力。我们发现hiPMs能促进人心肌细胞增殖，而hiPM-cm通过激活多种促增殖信号通路重现了这种作用，分泌蛋白质组分析确定了参与其中五种蛋白质。随后的体内实验表明，hiPM-cm可促进小鼠成体心肌细胞增殖。最后，hiPM-cm增强了损伤的成体小鼠心脏的心脏再生并改善了收缩功能。总之，我们的研究证明了使用hiPM-cm促进成体心肌细胞增殖和心脏再生的有效性，可作为心脏病的创新治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人iPSC来源的原始巨噬细胞及其条件培养基是否能促进成体心肌细胞增殖和心脏再生，其机制是什么？
- 核心机制
- hiPM-cm中的五种分泌蛋白（C1QB、NRP1、PLTP、FUCA1和SERPING1）通过激活PI3K/AKT、JAK/STAT和MAPK信号通路，协同促进心肌细胞增殖。
- 主要证据
- 在2D和3D共培养体系中hiPMs促进人心肌细胞增殖；hiPM-cm在体外可促进人心肌细胞增殖并激活相关通路；在成体小鼠心肌内注射hiPM-cm增加Ki67、pHH3、Aurora B阳性心肌细胞，并在I/R损伤后改善心脏功能。
- 研究意义
- hiPM-cm作为无细胞疗法，在促进心肌细胞增殖和心脏再生方面具有治疗潜力，为心脏病提供创新治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证hiPMs促进人心肌细胞增殖（2D和3D共培养）
检测hiPMs是否能在体外促进人心肌细胞增殖。
将hiPMs与hiPSC来源的人心肌细胞在2D和3D培养系统中共培养，然后通过Ki67免疫荧光染色评估心肌细胞增殖。
验证hiPM-cm促进人心肌细胞增殖
测试hiPMs分泌的条件培养基是否具有促增殖作用。
收集hiPMs培养48小时的条件培养基（hiPM-cm），处理人心肌细胞4天，检测细胞计数、融合度、Ki67阳性比例、心脏球大小、αSMA、代谢等指标。
蛋白质组学分析及组分验证
鉴定hiPM-cm中促进心肌细胞增殖的关键蛋白。
通过3-kDa超滤分离组分，LC-MS分析hiPM-cm和hiPMpre-cm差异蛋白，结合已报道的组织驻留巨噬细胞分泌基因，筛选9个候选蛋白，评估单独及组合处理对心肌细胞增殖的影响。
验证hiPM-cm激活PI3K/AKT、JAK/STAT和MAPK通路
探究hiPM-cm诱导心肌细胞增殖的分子机制。
对处理hiPM-cm和FM的人心肌细胞进行RNA-seq分析，KEGG富集发现PI3K/AKT、JAK/STAT、MAPK通路；免疫印迹检测通路蛋白磷酸化水平；使用通路抑制剂验证其对增殖的抑制作用。
体内验证hiPM-cm促进成体小鼠心肌细胞增殖
测试hiPM-cm在正常成体小鼠心脏中是否促进心肌细胞增殖。
对8周龄C57BL/6J小鼠心肌内单次注射PBS、FM或hiPM-cm，一周后检测心肌细胞增殖标志物，并使用MADM小鼠验证心肌细胞分裂。同时结合通路抑制剂注射，验证通路参与。
在I/R损伤模型中评估hiPM-cm的心脏保护和再生作用
验证hiPM-cm在心肌缺血再灌注损伤后的治疗效果。
对8周龄C57BL/6J小鼠进行心肌缺血再灌注（I/R）手术，在再灌注前5分钟心肌内注射FM或hiPM-cm，通过ELISA、组织染色、免疫荧光和超声检查等评估心脏损伤、纤维化、心肌细胞增殖和心脏功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | PSCeasyII培养基 | Cellapy | CA1014500 |
| 基质胶 | Corning | 356230 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| EDTA | -- | -- | |
| 分化诱导 | 激活素A | STEMCELL Technologies | 78001 |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | STEMCELL Technologies | 78003 | |
| 骨形态发生蛋白4 | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| 干细胞因子 | STEMCELL Technologies | 78062 | |
| 血管内皮生长因子 | Novoprotein | C083 | |
| 白细胞介素-3 | Novoprotein | CX90 | |
| X-VIVO 15培养基 | Lonza | 04-418Q | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Novoprotein | C417 | |
| GlutaMax添加剂 | Gibco | 35050061 | |
| 心肌细胞分化 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875-093 |
| B27无胰岛素添加剂 | Gibco | A1895601 | |
| CHIR99021 | Selleck | S2924 | |
| IWR-1 | Selleck | S7086 | |
| Accutase消化液 | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| 心脏成纤维细胞分化 | advanced DMEM/F-12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 |
| 视黄酸 | Sigma | R2625 | |
| SB431542 | Selleck | S1067 | |
| PromoCell成纤维细胞生长培养基 | PromoCell | C-23025 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875-093 |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞分化 | 佛波酯 | Abcam | ab120297 |
| 细胞培养 | TryPLE消化液 | Gibco | 12605010 |
| 条件培养基获取 | Amicon Ultra-2离心过滤装置 | Merck | UFC200324 |
| 免疫荧光染色 | Hoechst 33342 | Beyotime | C1022 |
| FITC标记葡聚糖 | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| 代谢分析 | Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | XF9637 |
| 葡萄糖 | Diamond | A100188 | |
| 寡霉素 | Merck Millipore | 495455 | |
| 2-脱氧葡萄糖 | SIGMA | D8375-1G | |
| CCK8试剂盒 | Beyotime | C0037 | |
| FCCP | Selleck | S8276 | |
| 鱼藤酮 | Selleck | S2348 | |
| ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0026 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 | |
| 钙处理检测 | Fluo-4, AM | Abcam | ab241082 |
| RNA-seq | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7530L |
| Illumina测序平台 | Illumina | -- | |
| qPCR | FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒V2 | Vazyme | RC112-01 |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | M1632 | |
| Taq Pro通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q712-03 | |
| 蛋白质组学 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| EASY-nLC 1200液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Exploris 240质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C18捕集柱 | Dr. Maisch GmbH | -- | |
| C18分析柱 | Dr. Maisch GmbH | -- | |
| 候选蛋白 | 转铁蛋白 | Novoprotein | CJ41 |
| 神经纤毛蛋白2 | Sino Biological | 10695-H08H | |
| SERPING1 | Novoprotein | C539 | |
| C1QC | Abclonal | RP01865 | |
| GAS6 | Novoprotein | C01W | |
| C1QB | MCE | HY-P75464 | |
| FUCA1 | Sino Biological | 13893-H08H | |
| 神经纤毛蛋白1 | Novoprotein | C11K | |
| PLTP | Sino Biological | 11171-H08H | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778075 |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime | P3001 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | LabLead | C0101 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| NcmECL Ultra化学发光液 | NCM Biotech | P10300 | |
| 通路抑制剂 | A-674563 HCl | Selleck | S2670 |
| PD0325901 | Selleck | S1036 | |
| Stattic | MCE | HY-13818 | |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Selleck | S1238 |
| 心肌损伤检测 | 心肌肌钙蛋白T ELISA试剂盒 | Yutong | F7649B |
| 氯化三苯基四氮唑 | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| 组织染色 | Masson三色染色试剂盒 | -- | TRM-1 |
| 小麦胚芽凝集素 | Thermo Fisher Scientific | W11261 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hiPM分化 | 分化因子浓度、时间窗口、细胞因子来源品牌及货号 阅读提示：Methods: Generation of hiPSC-derived primitive macrophage precursors (hiPMpres) and primitive macrophages (hiPMs) |
| 共培养实验 | 共培养比例、细胞密度、培养时间、培养基组成 阅读提示：Methods: Cell coculturing |
| hiPM-cm制备 | 细胞数量、孵育时间、离心参数、培养基（RPMI+B27） 阅读提示：Methods: Acquisition of conditioned medium |
| 通路抑制剂处理 | 抑制剂浓度、处理时间、给药方式（体外或体内） 阅读提示：Methods: In vitro treatment with inhibitors for pro-proliferative pathways; In vivo treatment with inhibitors for pro-proliferative pathways |
| I/R手术 | 结扎时间（40分钟）、再灌注时间、注射时机（再灌注前5分钟）、注射剂量（40μL）、注射位点 阅读提示：Methods: Myocardial ischemia/reperfusion injury; Intramyocardial injection of conditioned medium |