MPXV表面蛋白的系统筛选
鉴定能诱导有效中和抗体的MPXV表面蛋白抗原
构建编码27个MV表面蛋白和6个EV表面蛋白的mRNA，包封入LNP后免疫BALB/c小鼠，通过中和试验评估血清抗体的中和效力。
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一种猴痘病毒mRNA疫苗通过协同激活体液和细胞免疫应答抑制感染
An mRNA vaccine against monkeypox virus inhibits infection by co-activation of humoral and cellular immune responses.
实验完整度
高包括体外中和试验筛选抗原、多价疫苗免疫效果评估、被动转移实验、CD8+T细胞耗竭实验及体内攻毒保护实验等多个证据层级，并含功能与机制验证。
主要模型
BALB/c小鼠 HLA-A*02:01/DR1转基因小鼠
重点核对
疫苗剂量：MPXV表面蛋白mRNA疫苗12μg/只，MPX-EPs 3μg/只，混合疫苗MPX-m-Mix含12μg Mix-12和3μg MPX-EPs 免疫方案：初次免疫后3周加强，检测时间分别为加强后14天或21天等 攻毒剂量：BALB/c小鼠为1.0×10^6 PFU，HLA转基因小鼠为1.0×10^7 PFU 被动转移：血浆200μl/只，CD8+或CD4+ T细胞2.0×10^7个/只 CD8+ T细胞耗竭：抗CD8-α抗体（Bio X Cell, BE0061）或IgG2b同型对照，100μg/只，攻毒前第-1天和第0天注射
摘要
持续性的猴痘疫情加剧了对猴痘疫苗的需求。基于mRNA疫苗平台，我们对来自两种病毒颗粒（细胞外包膜病毒（EVs）和细胞内成熟病毒（MVs））的猴痘病毒（MPXV）表面蛋白进行了系统性筛选。该筛选揭示了12种具有不同水平中和免疫原性的重要抗原。进一步评估显示，这些抗原的4、8和12种组合，即Mix-4、Mix-8和Mix-12，可诱导不同程度的免疫保护，其中Mix-12效力最强。这一发现证明了中和抗体的水平以及多样性在提供强效免疫保护中的重要性。此外，我们采用T细胞表位富集策略，分析MPXV的完整蛋白质组序列以预测抗原表位富集区域。将这些表位富集区域整合到靶向细胞免疫的抗原（命名为MPX-EPs）中，表明靶向细胞免疫的mRNA疫苗可以独立地赋予免疫保护。此外，Mix-12和MPX-EPs的共同免疫能够实现对MPXV攻击的完全保护。总之，这些结果表明通过特异性协调体液和细胞免疫反应来增强mRNA疫苗免疫保护效果的有效方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何设计一种针对猴痘病毒的mRNA疫苗，通过系统性筛选表面抗原和T细胞表位富集策略，协同激活体液和细胞免疫以提供有效的免疫保护？
- 核心机制
- 通过增加中和抗体的多样性（而非单纯提高抗体滴度）以及诱导强效的CD8+ T细胞介导的细胞免疫，协同增强抗猴痘病毒的保护性免疫反应。
- 主要证据
- 体外中和试验识别出12种表面抗原；Mix-12诱导最高水平的中和抗体并降低被动免疫小鼠肺部病毒载量；MPX-EPs在HLA转基因小鼠中激活CD8+ T细胞并依赖CD8+ T细胞提供保护；MPX-m-Mix（Mix-12+MPX-EPs）完全阻止肺部感染。
- 研究意义
- 该研究为开发针对猴痘及其他正痘病毒疫苗提供了新策略，强调通过合理抗原选择和协同激活体液与细胞免疫来提升疫苗效力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多价mRNA疫苗的制备与评估
探讨不同抗原组合（4价、8价、12价）对中和抗体水平和保护效力的影响
制备Mix-4、Mix-8和Mix-12三种mRNA疫苗混合物，免疫BALB/c小鼠，检测中和抗体滴度、IgG亚型，并通过被动转移和攻毒实验评估保护效力。
MPX-EPs的免疫原性评价
验证MPX-EPs mRNA疫苗诱导CD8+ T细胞免疫应答的能力
将MPX-EPs mRNA免疫HLA-A*02:01/DR1转基因小鼠，通过流式细胞术、ELISpot、细胞内细胞因子染色和四聚体染色评估CD8+ T细胞应答，并通过CD8+ T细胞耗竭实验评估其保护作用。
协同免疫策略的体内保护效力评估
评估Mix-12和MPX-EPs联合免疫（MPX-m-Mix）对MPXV攻毒的保护效果
免疫HLA-A*02:01/DR1转基因小鼠，检测体液和细胞免疫应答，并在加强免疫后3周进行MPXV攻毒，评估肺部病毒载量和病理变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 含GlutaMAX的DMEM培养基 | Gibco | 10566016 |
| 胎牛血清 | PAN-Biotech | ST220622 | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300120 | |
| mRNA转染 | TransIT®-mRNA转染试剂 | Mirus Bio | MIR-2250 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985062 | |
| Western blot | HRP标记的抗His标签抗体 | Sino Biological | 105327-MM02T-H |
| 蛋白酶体抑制 | MG132 | APEXBIO | A2585 |
| 流式细胞术 | Cytofix/Cytoperm固定/破膜试剂 | BD Biosciences | BDB554714 |
| 抗V5标签小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 80076S | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L (Cy3®)抗体 | Abcam | ab97035 | |
| 脂质纳米颗粒制备 | 可电离脂质ALC-0315 | -- | -- |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 | -- | -- | |
| 胆固醇 | -- | -- | |
| 聚乙二醇化脂质ALC-0159 | -- | -- | |
| Amicon超滤离心管 | -- | -- | |
| Quant-iT RiboGreen RNA定量试剂盒 | Invitrogen | R11490 | |
| 脂质纳米颗粒表征 | 日立HT-7700透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 马尔文Zetasizer Nano-ZS90粒度仪 | Malvern Instruments | -- | |
| ELISA | TMB底物 | Sigma | T0440 |
| HRP标记的抗小鼠IgG抗体 | Invitrogen | A16066 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG1抗体 | Invitrogen | PA1-74421 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG2a抗体 | Invitrogen | A-10685 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG2c抗体 | Abcam | ab97255 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG2b抗体 | Invitrogen | SA5-10266 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG3抗体 | Invitrogen | M32607 | |
| HRP标记的抗小鼠IgA抗体 | Proteintech | SA00012-7 | |
| ELISpot | 小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒 | Abcam | ab64029 |
| IL-4 ELISpot试剂盒 | Mabtech | 3311-4HPW-10 | |
| 流式细胞术 | Ghost Dye™ Red 780活力染料 | TONBO Biosciences | 13-0865-T100 |
| 抗CD45-Alexa Fluor™ 700抗体 | Invitrogen | 56-0451-82 | |
| 抗CD8-PerCP-Cyanine5.5抗体 | TONBO Biosciences | 65-0081-U100 | |
| 抗CD62L-BV421抗体 | Biolegend | 104436 | |
| 抗CD107a-BV711抗体 | BioLegend | 121631 | |
| 抗IFN-γ-PE抗体 | TONBO Biosciences | 50-7311-U100 | |
| 抗TNF-α-BV421抗体 | BioLegend | 506328 | |
| 抗颗粒酶B-FITC抗体 | BioLegend | 372206 | |
| 抗CD69-FITC抗体 | Biolegend | 104506 | |
| 抗CD103-AF594抗体 | Biolegend | 121428 | |
| 抗CD4-FITC抗体 | Tonbo Biosciences | 35-0042-U100 | |
| 抗CD185-Brilliant Violet 605™抗体 | BioLegend | 145513 | |
| 抗PD-1-Brilliant Violet 421™抗体 | BioLegend | 135218 | |
| 抗B220-PerCP-Cyanine5.5抗体 | TONBO Biosciences | 65-0452-U100 | |
| 抗CD95-PE抗体 | BioLegend | 152608 | |
| 抗GL-7-APC抗体 | BioLegend | 144618 | |
| 细胞染色缓冲液 | BioLegend | 420201 | |
| 细胞因子检测 | 多因子流式检测试剂盒 | BioLegend | 740150 |
| IL-2 ELISA试剂盒 | Invitrogen | BMS601 | |
| 颗粒酶B ELISA试剂盒 | Invitrogen | BMS6029 | |
| HLA四聚体制备 | HLA-A*02:01四聚体试剂盒(PE) | MBL International Corporation | TB-7300-K1 |
| 动物实验 | 抗小鼠CD8-α (IgG2b)单克隆抗体 | Bio X Cell | BE0061 |
| IgG2b同型对照单克隆抗体 | Bio X Cell | BE0090 | |
| 疫苗制备 | Alhydrogel®佐剂2% | InvivoGen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MPXV表面蛋白筛选 | mRNA剂量12μg/只，免疫间隔3周，检测时间加强后14天，BALB/c小鼠每组5只，中和试验使用MPXV毒株hMpxV/China/GZ8H-01/2023，筛选阈值1:50稀释中和率>60% 阅读提示：Fig. 1a-c及方法部分'Animal immunization'第1条 |
| 多价疫苗保护效力评估 | 疫苗总mRNA剂量12μg/只，等比例混合，BALB/c小鼠每组6只，被动转移血浆200μl/只，攻毒剂量1.0×10^6 PFU，攻毒后4天检测肺部病毒载量 阅读提示：Fig. 2a-f及方法部分'MPXV challenge studies'第(1)和(2)条 |
| MPX-EPs免疫原性评价 | mRNA剂量3μg/只，免疫间隔3周，检测时间加强后3周，HLA-A*02:01/DR1转基因小鼠雌性4-5周，每组n=6，CD8+T细胞耗竭抗体剂量100μg/只，攻毒剂量1.0×10^7 PFU 阅读提示：Fig. 3a-k及方法部分'Animal immunization'第3条和'MPXV challenge studies'第(3)条 |
| 协同免疫策略评估 | MPX-m-Mix包含12μg Mix-12和3μg MPX-EPs；MPX-p-Mix包含12μg重组蛋白和3μg肽段并添加150μg Alum佐剂；免疫间隔3周；攻毒剂量1.0×10^7 PFU；攻毒后4天检测 阅读提示：Fig. 4a-k及方法部分'Animal immunization'第4条和'MPXV challenge studies'第(4)条 |