构建动物毒液、元毒液及人分泌组文库
生成涵盖广泛序列多样性的多肽展示文库。
从UniProt提取21,311条毒液序列、通过MMseqs2搜索BFD和Serratus数据库获得41,136条元毒液序列，以及880个人类分泌蛋白序列，经合成和克隆至M13-70噬菌粒载体。
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动物元毒液组的分子展示用于发现新型治疗性多肽
Molecular Display of the Animal Meta-Venome for Discovery of Novel Therapeutic Peptides.
实验完整度
高包含文库构建、细胞与珠基筛选、流式结合、PRESTO-Tango功能实验、细胞毒性分析及AlphaFold/RosettaDock结构预测等多个独立证据层级。
主要模型
M13噬菌体展示文库 EGFR过表达细胞系（MDA-MB-468、MDA-MB-231、NCI-H358） MRGPRX4过表达HEK293细胞 HTLA-MRGPRX4细胞系
重点核对
M13-70载体使用70氨基酸连接子 单轮筛选采用三重复，显著富集阈值为p<0.001、倍数变化≥5、三样本中两个读段数≥15 MRGPRX4阳性配体ERR1712142|105-166结合验证 PRESTO-Tango实验中UDCA浓度及TFPI/SPINT2的EC50 阴性对照蛋白（骨保护素、抑肽酶）
摘要
动物毒液以其独特的结构特征和强效生物活性，代表着一个巨大且相对未开发的治疗分子库。然而，全面构建和表达高度复杂的毒液及毒液样分子文库的局限性，阻碍了通过高通量筛选进行其治疗评估。在这里，我们开发了一种创新计算方法，用于设计高度多样化的动物毒液和“元毒液”文库。我们使用可编程的M13超级噬菌体展示来保留关键的二硫键结构，用于高度并行化的单轮生物淘选，并通过高通量DNA测序进行定量。我们的方法发现了含有Kunitz型结构域的蛋白质，这些蛋白质靶向瘙痒相关G蛋白偶联受体X4（MRGPRX4），该受体在瘙痒感知中起关键作用。基于深度学习的结构同源性挖掘确定了两个内源性人类同源物，组织因子途径抑制剂（TFPI）和丝氨酸肽酶抑制剂Kunitz型2（SPINT2），它们表现出激动剂依赖性增强MRGPRX4的活性。因此，高度多重化的动物毒液和元毒液筛选是发现新候选药物的有前景的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何构建并应用高度多样化的动物毒液和元毒液文库，以高通量发现针对膜受体的新型治疗性多肽配体？
- 核心机制
- Kunitz型结构域蛋白（如TFPI和SPINT2）作为正向变构调节剂，在激动剂UDCA存在下增强MRGPRX4信号传导。
- 主要证据
- 流式细胞术证实TFPI、SPINT2与MRGPRX4结合；PRESTO-Tango实验显示它们增强MRGPRX4介导的β-arrestin募集。
- 研究意义
- 该平台可用于发现新型药物先导化合物，并可能为治疗胆汁淤积性瘙痒等疾病提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
优化M13超噬菌体展示和单轮筛选流程
验证噬菌体展示系统能有效富集已知配体，并确定最佳连接子长度。
以EGF-EGFR相互作用为阳性对照，测试不同连接子长度（13-291 aa）在不同EGFR表达水平的细胞系上的富集效果；并比较M13与T7展示系统对二硫键形成的影响。
筛选针对EGFR和MRGPRX4的候选配体
从复合文库中鉴定特异性结合目标受体的多肽。
使用细胞基和珠基淘选方法，分别针对EGFR过表达细胞和EGFR-Fc包被磁珠，以及MRGPRX4过表达细胞进行单轮筛选，通过NGS测序和edgeR分析鉴别显著富集的多肽。
验证候选配体结合及功能活性
确认候选多肽对MRGPRX4结合并测试其调节受体信号的能力。
对ERR1712142|105-166进行FLAG-标签流式结合分析；对TFPI、SPINT2和APP751进行His-标签流式结合分析；利用PRESTO-Tango实验检测TFPI和SPINT2对UDCA诱导的MRGPRX4信号的影响，并排除细胞毒性。
结构建模和同源物挖掘
预测候选配体的结合模式，并寻找与毒液肽结构相似的内源性人类蛋白。
使用AlphaFold-Multimer和RosettaDock预测配体与EGFR或MRGPRX4的结合模式；用Foldseek搜索人类蛋白组结构同源物，发现TFPI和SPINT2等Kunitz型抑制剂。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 噬菌体文库构建 | pSEX81噬菌粒 | PROGEN | PR3005 |
| EcoRI限制性内切酶 | NEB | R3101 | |
| HindIII限制性内切酶 | NEB | R3104 | |
| 2%低熔点琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 16500100 | |
| Herculase II融合DNA聚合酶 | Agilent | 600679 | |
| QIAGEN柱纯化试剂盒 | QIAGEN | 28104 | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202T | |
| TOP10F′电转感受态细胞 | Thermo Fisher Scientific | 44-0002 | |
| 噬菌体生产 | 超噬菌体 | PROGEN | PRHYPE |
| 噬菌体纯化 | 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836170001 |
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | -- | -- |
| 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| 慢病毒转导 | pCDH慢病毒表达载体 | -- | -- |
| pPACKH1 HIV慢病毒包装系统 | System Biosciences | LA500A-1 | |
| GeneJuice转染试剂 | Sigma-Aldrich | 70967 | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| 流式细胞术 | 小鼠抗EGFR单克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-13070 |
| 小鼠抗CXCR2单克隆抗体 | R&D Systems | MAB331 | |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 488二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| 细胞基筛选 | 细胞解离缓冲液 | Corning | 25-056-CI |
| Quick-DNA/RNA小提试剂盒 | Zymo | D7011 | |
| 核糖核酸酶A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| 珠基筛选 | EGFR-Fc融合蛋白 | R&D Systems | 344-ER |
| 依那西普 | MilliporeSigma | 185243-69-0 | |
| 蛋白G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10009D | |
| 结合实验 | 组织因子途径抑制剂 | Acro Biosystems | TFI-H5226 |
| 丝氨酸肽酶抑制剂Kunitz型2 | Sino Biological | 10324-H08H | |
| β-淀粉样前体蛋白751亚型 | BioLegend | 842601 | |
| 流式细胞术 | Alexa Fluor 647偶联FLAG标签抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA1-142-A647 |
| Alexa Fluor 647偶联His标签抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA1-21315-A647 | |
| 细胞功能实验 | Bright-Glo发光底物 | Promega Corporation | E2620 |
| 细胞毒性检测 | CyQUANT乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒 | Invitrogen | C20300 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 噬菌体文库构建 | 载体为pSEX81修饰的M13噬菌粒，插入位点为EcoRI和HindIII，使用70氨基酸连接子；文库序列长度限制 阅读提示：Methods: M13 Phagemid and Linker Design; Animal Venom, Metavenome, and Human Secretome Library Design and Synthesis |
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件，包括培养基、血清、抗生素和湿度/CO2条件 阅读提示：Methods: Cell Lines and Culture |
| EGFR过表达细胞系生成 | 慢病毒转导方法，pCDH载体、pPACKH1包装系统、GeneJuice转染试剂和polybrene浓度 阅读提示：Methods: Generation of an EGFR-Overexpressing Stable HEK 293T Cell Line |
| 单轮细胞和珠基筛选 | 筛选流程、细胞数量、噬菌体文库数量、孵育时间和温度，、洗涤步骤；显著富集阈值 阅读提示：Methods: Single-Round Cell-Based and Bead-Based Screening; NGS Sequencing and Data Analysis |
| 结合验证 | 候选配体蛋白浓度、标签、抗体稀释度、孵育时间 阅读提示：Methods: Binding Assay for ERR1712142|105-166 and Human Structural Homologs Screening Against MRGPRX4 |
| 功能检测 | HTLA-MRGPRX4细胞密度、UDCA浓度、TFPI/SPINT2浓度、孵育时间、发光检测 阅读提示：Methods: PRESTO-Tango Assay |
| 细胞毒性检测 | LDH检测步骤、细胞处理条件、染色和读数波长 阅读提示：Methods: Lactate Dehydrogenase Cytotoxicity Assay |