KLK13对刺突蛋白的切割活性鉴定
验证KLK13是否特异性切割SARS-CoV-2刺突蛋白。
将KLK13与SARS-CoV-2刺突蛋白共转染至HEK293T细胞，通过免疫印迹检测切割片段。
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鼻黏液来源的KLK13通过蛋白水解切割刺突蛋白限制SARS-CoV-2感染
Nasal mucus-derived KLK13 restricts SARS-CoV-2 infection via proteolytic cleavage of spike.
实验完整度
高包含体外切割实验、细胞融合实验、假病毒进入实验、CRISPRa激活内源基因、小鼠体内实验及临床样本分析等多个证据层级。
主要模型
HEK293T细胞 A549-hACE2-TMPRSS2细胞 K18-hACE2转基因小鼠 SARS-CoV-2 GFP/ΔN病毒样颗粒系统
重点核对
KLK13的蛋白酶活性（野生型vs S218A突变体） KLK13的剂量依赖性 CRISPRa sgRNA #2对KLK13的激活效率 重组KLK13蛋白的激活条件（赖氨酰内肽酶）
摘要
上皮纤毛是抵抗呼吸道病原体的第一道防线。我们首次发现，激肽释放酶相关肽酶13（KLK13），一种在气道纤毛上皮细胞中具有细胞类型特异性表达的丝氨酸蛋白酶，被分泌到鼻黏液中。KLK13有效切割SARS-CoV-2的刺突蛋白，从而抑制SARS-CoV-2进入细胞以及刺突蛋白介导的细胞间融合。重组KLK13蛋白酶在体外有效切割刺突蛋白以及病毒颗粒。只有KLK13，而不是KLK家族的其他成员，特异性切割SARS-CoV-2以及其他冠状病毒的刺突蛋白。我们还证实，在A549细胞中通过CRISPR激活（CRISPRa）刺激的内源性KLK13抑制了SARS-CoV-2假病毒进入。KLK13的mRNA水平在A549和HeLa细胞中均被poly（I:C）刺激升高，其在SARS-CoV-2感染的临床样本中的表达水平也增加。重组腺相关病毒包装的KLK13（AAV-KLK13）在K18-ACE2小鼠模型中减少了SARS-CoV-2复制。总的来说，鼻黏液来源的KLK13作为冠状病毒的剪刀，并有可能进一步开发为广谱抗冠状病毒药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鼻黏液中的KLK13是否通过切割冠状病毒刺突蛋白来限制SARS-CoV-2感染？
- 核心机制
- KLK13通过其丝氨酸蛋白酶活性切割SARS-CoV-2刺突蛋白，抑制病毒进入和刺突介导的细胞间融合，从而限制病毒感染。
- 主要证据
- 体外切割实验显示重组KLK13切割刺突蛋白和病毒颗粒；KLK13过表达或CRISPRa激活内源KLK13抑制假病毒进入；AAV-KLK13鼻内给药降低K18-ACE2小鼠肺和鼻甲中的病毒载量。
- 研究意义
- KLK13作为鼻黏液中的一种新型限制因子，具有发展成广谱抗冠状病毒药物的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
重组KLK13对刺突蛋白和病毒颗粒的体外切割
确认KLK13直接切割刺突蛋白和病毒颗粒上的刺突。
将纯化的SARS-CoV-2刺突蛋白或病毒样颗粒与激活的KLK13孵育，通过Western blot检测切割。
验证KLK13对多种冠状病毒刺突的切割谱
检测KLK13是否切割其他冠状病毒的刺突蛋白。
将KLK13与各冠状病毒刺突表达质粒共转染HEK293T细胞，免疫印迹检测切割。
KLK13与刺突的相互作用及对合胞体形成的抑制
验证KLK13是否与刺突结合并抑制刺突介导的细胞融合。
通过共免疫沉淀和免疫荧光检测相互作用；通过细胞融合实验检测合胞体形成。
过表达或激活内源KLK13对SARS-CoV-2假病毒进入的抑制
测试KLK13是否抑制SARS-CoV-2假病毒进入细胞。
在HEK293T-ACE2细胞中过表达KLK13或通过CRISPRa激活内源KLK13，进行假病毒进入实验。
分泌性KLK13对假病毒进入的抑制
检查分泌的KLK13是否抑制假病毒进入。
收集KLK13过表达细胞的培养上清，浓缩后与假病毒孵育，然后进行进入实验。
KLK13在K18-ACE2小鼠模型中的抗病毒作用
评估KLK13在体内的抗SARS-CoV-2作用。
K18-hACE2小鼠鼻内给予AAV-KLK13或AAV-EGFP，30天后感染SARS-CoV-2，2天后检测病毒载量和病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | VivaCell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 潮霉素 | -- | -- | |
| 质粒转染 | 聚乙烯亚胺 | Sigma | -- |
| Fugene转染试剂 | Promega | E2311 | |
| 蛋白检测 | 兔抗KLK13抗体 | Novus | NB200-139 |
| 兔抗SARS-CoV-2刺突抗体 | Proteintech | 28867-1-AP | |
| 兔抗SARS核衣壳抗体 | ROCKLAND | 200-401-A50 | |
| 兔抗PCSK4抗体 | Proteintech | 15106-1-AP | |
| 兔抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724S | |
| 兔抗IgG对照抗体 | Proteintech | 30000-0-AP | |
| 小鼠抗HA标签抗体 | Proteintech | 66006-2-Ig | |
| 小鼠抗His标签抗体 | Proteintech | 66005-1-Ig | |
| 小鼠抗Strep II标签抗体 | ABclonal | AE066 | |
| 小鼠抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 81115-1-RR | |
| 小鼠抗FLAG标签抗体 | MBL | M185-3 | |
| 小鼠抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Jackson | 115-035-003 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠FITC二抗 | Jackson | 015-090-050 |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 568二抗 | Invitrogen | A11036 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 抗淬灭封片剂 | Vector | H-1000-10 | |
| 细胞培养 | MagZol试剂 | Magen | -- |
| RT-qPCR | HiScript II Q RT SuperMix逆转录试剂盒 | Vazyme | -- |
| ChamQ通用型SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| 蛋白检测 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| 化学发光HRP底物 | Merck | WBKLS0500 | |
| 免疫共沉淀 | 抗HA磁珠 | Pierce | 88836 |
| 病毒实验 | SARS-CoV-2刺突（S1+S2 ECD）重组蛋白 | SinoBiological | 40589-V27B-B |
| 重组人KLK13蛋白 | SinoBiological | 10199-H08H | |
| 赖氨酰内肽酶 | Wako | JP05061 | |
| KLK13抑制剂肽（Biotin-VRFR-CMK） | Sangon Biotech | -- | |
| CRISPR激活 | Lenti-SAM-v2-puro质粒 | Addgene | 92062 |
| Lenti-MS2-P65-HSF1 Hygro质粒 | Addgene | 61426 | |
| 动物实验 | TissueLyzer II组织研磨仪 | Qiagen | -- |
| 组织学 | Leica TP1020半封闭式台式组织处理机 | Leica | -- |
| 奥林巴斯BX53光学显微镜 | Olympus | -- | |
| 荧光成像 | 尼康C2共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件：HEK293T、HeLa、A549、Caco-2、Calu-3、BEAS-2B、A549-hACE2-TMPRSS2、HEK293T-ACE2、Vero E6-TMPRSS2，培养基和添加剂如FBS浓度、抗生素、筛选药物（嘌呤霉素、潮霉素） 阅读提示：Methods中的Cell culture部分 |
| 质粒转染 | 转染试剂（PEI、Fugene），质粒比例，转染时间 阅读提示：Methods中的Plasmids部分 |
| KLK13切割实验 | 重组KLK13蛋白的激活条件（赖氨酰内肽酶浓度、时间），刺突蛋白浓度，反应缓冲液，孵育时间和温度 阅读提示：Methods中的SARS-CoV-2 spike cleavage experiment in vitro部分 |
| 假病毒进入实验 | 假病毒包装质粒比例，细胞转染量，感染时间，荧光素酶检测时间 阅读提示：Methods中的Pseudovirus packaging and pseudovirus entry assay部分 |
| 细胞融合实验 | 效靶细胞比例，共培养时间，观察视野数 阅读提示：Methods中的Cell-cell fusion assay部分 |
| CRISPR激活 | sgRNA序列，质粒比例，转导时间，筛选策略 阅读提示：Methods中的CRISPR activation部分 |
| 动物实验 | 小鼠品系、周龄、性别，rAAV剂量和体积，感染病毒株和剂量，时间点，样本处理 阅读提示：Methods中的Animal experiments部分 |